Aktivierung des Urotensins

May 30, 2023

Communications Biology Band 6, Artikelnummer: 511 (2023) Diesen Artikel zitieren

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Remdesivir ist ein antivirales Medikament, das weltweit zur Behandlung von COVID-19 eingesetzt wird. Kardiovaskuläre Nebenwirkungen wurden mit Remdesivir in Verbindung gebracht; Der zugrunde liegende molekulare Mechanismus bleibt jedoch unbekannt. Hier führten wir ein groß angelegtes G-Protein-gekoppeltes Rezeptor-Screening in Kombination mit Strukturmodellierung durch und fanden heraus, dass Remdesivir ein selektiver, partieller Agonist für den Urotensin-II-Rezeptor (UTS2R) über die Gαi/o-abhängige AKT/ERK-Achse ist. Funktionell induzierte die Behandlung mit Remdesivir ein verlängertes Feldpotential und APD90 in aus humanen induzierten pluripotenten Stammzellen (iPS) gewonnenen Kardiomyozyten und beeinträchtigte die Kontraktilität sowohl bei neonatalen als auch bei erwachsenen Kardiomyozyten, was alles die klinische Pathologie widerspiegelt. Wichtig ist, dass Remdesivir-vermittelte Herzfehlfunktionen durch die Antagonisierung der UTS2R-Signalübertragung wirksam abgeschwächt wurden. Schließlich haben wir die Wirkung von 110 Einzelnukleotidvarianten im UTS2R-Gen charakterisiert, die in der Genomdatenbank gemeldet wurden, und vier Missense-Varianten gefunden, die Funktionsgewinneffekte bei der Rezeptorempfindlichkeit gegenüber Remdesivir zeigen. Insgesamt beleuchtet unsere Studie einen bisher unbekannten Mechanismus, der Remdesivir-bedingten kardiovaskulären Ereignissen zugrunde liegt, und dass genetische Variationen des UTS2R-Gens ein potenzieller Risikofaktor für kardiovaskuläre Ereignisse während der Remdesivir-Behandlung sein können, was insgesamt den Weg für eine therapeutische Möglichkeit ebnet, solche Ereignisse zu verhindern Zukunft.

Nukleosidanaloga haben eine lange Geschichte im Bereich der Arzneimittelentwicklung für die antivirale Behandlung, da Nukleoside als Bausteine ​​sowohl für die DNA- als auch für die RNA-Synthese während der Virusreplikation verwendet werden1. Der primäre Mechanismus der antiviralen Wirkung von Nukleosidanaloga wird auf die Hemmung der viralen RNA-abhängigen RNA-Polymerase2 zurückgeführt. Als Reaktion auf die globale Pandemie von COVID-19 wurden mehrere Nukleosidanaloga wie Remdesivir, Molnupiravir und Favipiravir zur Behandlung der Krankheit entwickelt.

Remdesivir (GS-5734; Veklury) ist ein modifiziertes Adenosinanalogon, das einen McGuigan-Prodrug-Anteil enthält, einschließlich Phenol und L-Alaninethylbutylester, der seine Lipophilie und Zellpermeabilität erhöht3. Nach intravenöser Verabreichung wird Remdesivir schnell in die Mononukleosidform (GS-441524) umgewandelt und intrazellulär von mehreren Wirtsenzymen zu seiner pharmakologisch aktiven Triphosphatform metabolisiert, die wiederum als wirksamer und selektiver Inhibitor der RNA-Form wirkt. abhängige RNA-Polymerase mehrerer Viren4,5. Remdesivir wurde ursprünglich zur Behandlung des Ebola-Virus6 eingesetzt und wurde inmitten der globalen Pandemie zur Behandlung der Coronavirus-Krankheit 2019 (COVID-19) zugelassen. Remdesivir verkürzte die Zeit bis zur Genesung bei Erwachsenen, die mit COVID-19 ins Krankenhaus eingeliefert wurden und Anzeichen einer Infektion der unteren Atemwege aufwiesen7. Neuere Daten zeigten eine signifikante Reduzierung der Krankenhauseinweisungen bei einer dreitägigen Behandlung mit intravenösem Remdesivir8. Obwohl Remdesivir im Allgemeinen von den meisten Menschen gut vertragen wird, wurden häufige Nebenwirkungen von Remdesivir berichtet, darunter Hautausschlag, Kopfschmerzen, Übelkeit, Durchfall und erhöhte Transaminasen7. Aktuelle Leitlinien für Remdesivir empfehlen eine sorgfältige Überwachung der Leberfunktion während der Behandlung und raten von der Anwendung bei Patienten mit Nierenfunktionsstörung ab9. Darüber hinaus wurde über kardiovaskuläre Ereignisse wie Hypotonie, Bradykardie, QT-Verlängerung und T-Wellen-Anomalie berichtet10,11,12,13. Bei intravenöser Verabreichung zeigt Remdesivir eine breite Gewebeverteilung, auch im Herzen14, aber der genaue molekulare Mechanismus, der den kardiovaskulären Nebenwirkungen von Remdesivir zugrunde liegt, bleibt unklar.

Molnupiravir (EIDD-2801/MK-4482; Lagevrio) wurde von der FDA im Rahmen einer Notfallzulassung für den Notfallgebrauch zur Behandlung von leichtem bis mittelschwerem COVID-19 bei Erwachsenen zugelassen, bei denen ein hohes Risiko für eine schwere Entwicklung besteht COVID 19. Molnupiravir ist ein orales Cytosin-Analogon, das ein Isopropylester-Prodrug des β-d-N4-Hydroxycytidins (NHC) enthält. Die aktive Form von NHC ist ein Substrat der viralen RNA-abhängigen RNA-Polymerase und beeinträchtigt die Genauigkeit der SARS-CoV-2-Replikation, was zu einer Fehlerkatastrophe führt15. Eine klinische Studie mit nicht hospitalisierten Erwachsenen zeigte, dass eine frühzeitige Behandlung mit Molnupiravir das Risiko einer Krankenhauseinweisung oder des Todes bei gefährdeten, ungeimpften Erwachsenen mit COVID-1916 wirksam reduzierte. Neben Molnupiravir wird auch Favipiravir (T-705; Avigan), ein Anti-Influenza-Medikament, zur Behandlung von COVID-19 klinisch getestet. Favipiravir sa Nukleobasenanalogon, abgeleitet von Pyrazincarboxamid (6-Fluor-3-hydroxy-2-pyrazincarboxamid)17. Die vorgeschlagenen Wirkmechanismen von Favipiravir umfassen eine Mischung aus Kettenabbruch- und Mutatorereignissen18. Während der Anwendung von Molnupiravir und Favipiravir wurden mehrere unerwünschte Ereignisse berichtet, darunter Durchfall, Schwindel und Übelkeit bei Molnupiravir19 sowie Hyperurikämie und erhöhte Alaninaminotransferase bei Favipiravir20. Wichtig ist, dass im Gegensatz zu Remdesivir bei der Anwendung von Molnupiravir oder Favipiravir keine kardiovaskulären Nebenwirkungen berichtet wurden.

Zusätzlich zu ihrer Funktion als Bausteine ​​für die DNA-/RNA-Synthese können Nukleotide/Nukleoside als endogene Liganden für G-Protein-gekoppelte Rezeptoren (GPCR) fungieren und verschiedene pathophysiologische Reaktionen auslösen21,22,23,24,25. Angesichts des Vorhandenseins nukleosidähnlicher Strukturen in Remdesivir, Molnupiravir und Favipiravir stellten wir die Hypothese auf, dass diese Medikamente durch die direkte Aktivierung von GPCR Nebenwirkungen verursachen könnten. Hier berichten wir, dass Remdesivir, nicht jedoch Molnupiravir und Favipiravir, ein selektiver Ligand für den Urotensin-II-Rezeptor (UTS2R) ist und Herzfunktionsstörungen verursacht.

Wir haben Anti-COVID-19-Medikamente, darunter Remdesivir, Molnupiravir und Favipiravir, anhand eines mit alkalischer Phosphatase markierten Transforming Growth Factor-α (AP-TGFα)-Shedding-Assays gegen 348 GPCRs gescreent26. Für das erste Screening verwendeten wir chimäre Proteine ​​der Gα-Untereinheit, um die Rezeptoraktivierung unabhängig von der Art der beteiligten Gα-Untereinheit effizient nachzuweisen26. Unter den drei Medikamenten haben wir herausgefunden, dass Remdesivir ein selektiver Aktivator für den Urotensin-II-Rezeptor (UTS2R) ist (Abb. 1a, ergänzende Abb. 1a, ergänzende Daten 1). Da Remdesivir die UTS2R-Reaktion ohne chimäres Gα-Protein wirksam induzierte, wurde die anschließende UTS2R-Analyse ohne die exogene Zugabe des chimären Gα-Proteins durchgeführt. Eine Konzentrations-Wirkungs-Analyse ergab, dass die halbmaximale wirksame Konzentration (pEC50) von Remdesivir 4,89 ± 0,03 betrug (EC50 = 13 ± 0,9 μM, Abb. 1b links). Es ist zu beachten, dass sowohl die Wirksamkeit als auch die Wirksamkeit von Remdesivir (Emax = 47 ± 1,4 % AP-TGFα-Freisetzung) gegenüber UTS2R geringer sind als die des endogenen peptidischen Liganden Urotensin-II (UT2, pEC50 = 10,72 ± 0,04; EC50 =). 21 ± 2,1 fM, Emax = 59 ± 0,70 %AP-TGFα-Freisetzung, Abb. 1b rechts). Dennoch wird davon ausgegangen, dass die Verabreichung von Remdesivir in einer klinischen Dosierung im Arbeitsbereich agonistischer Wirkungen liegt, da die maximale Plasmakonzentration von Remdesivir nach intravenöser Injektion bei gesunden Erwachsenen 9,03 μM erreicht27. Interessanterweise konnte Remdesivir im Gegensatz zu UT2 keine β-Arrestin-Rekrutierungsreaktion auslösen (Abb. 1c, ergänzende Abb. 1b).

a Chemische Strukturen der getesteten Verbindungen und Heatmaps, die die relativen Grade der GPCR-Aktivierung zeigen, gemessen mit dem TGFα-Shedding-Assay. Die Farbskala stellt die prozentuale GPCR-Aktivierung im Vergleich zur durch TPA (12-O-Tetradecanoylphorbol-13-acetat) vermittelten Rezeptoraktivierung dar, die unabhängig vom GPCR die maximale TGFα-Ausscheidungsreaktion induziert. Die gelbe Zelle stellt die Aktivierung von UTS2R durch Remdesivir dar. Die Konzentrationen der getesteten Verbindungen betrugen 10 μM für Remdesivir, Molnupiravir, GS-441524 und Sofosbuvir und 100 μM für Favipiravir (n = 3). b TGFα-Ausscheidungsreaktionskurven für UTS2R durch Remdesivir (links) und Urotensin-II (UT2, rechts) in Gegenwart oder Abwesenheit von Urantid, einem UTS2R-Antagonisten (Daten werden als Mittelwert ± SEM, n = 3) angezeigt. Die halbmaximale wirksame Konzentration (pEC50) von Remdesivir betrug 4,89 ± 0,03 (EC50 = 13 μM, Emax = 47 ± 1,4 % AP-TGFα-Freisetzung). Die halbmaximale wirksame Konzentration (pEC50) von UT2 betrug 10,72 ± 0,04 (EC50 = 21 fM, Emax = 59 ± 0,70 % AP-TGFα-Freisetzung). c Remdesivir- (links) oder Urotensin-II (UT2, rechts)-vermittelter β-Arrestin-1-Rekrutierungstest für UTS2R. Die Daten werden als Mittelwert ± SEM (n = 3) angezeigt. d, e Kompetitiver Bindungstest mit Biotin-UT2-Peptid. Die Membranfraktion von HEK293-Zellen, die FLAG-UTS2R (Eingabe) exprimierten, wurde mit Biotin-UT2 in Gegenwart oder Abwesenheit von Remdesivir oder Urantid inkubiert. FLAG-UTS2R wurde durch Streptavidin-beschichtete Magnetkügelchen (M280) heruntergezogen und FLAG-UTS2R wurde durch Western Blot nachgewiesen. d Es wurde ein repräsentatives Bild von drei unabhängigen Studien gezeigt. e-Band-Densitometrie. ***p < 0,001 und **p < 0,01 im Vergleich zur Gruppe mit Vehikel + 10 μM UT2 (einfaktorielle ANOVA, gefolgt von Dunnetts Mehrfachvergleichstest); bedeutet ± SEM.

Um zu beurteilen, ob Remdesivir direkt mit UTS2R interagieren kann, führten wir einen kompetitiven Bindungstest durch. Eine frühere Studie hat gezeigt, dass ein synthetisches UT2-Peptid mit einem N-terminalen Biotin-Tag (Biotin-UT2) eine stabile Bindung mit UTS2R28 eingehen kann. Wichtig ist, dass die Bindung stabil genug war, um UTS2R mithilfe von Streptavidinharz biochemisch herunterzufahren. Unter Ausnutzung der einzigartigen Eigenschaft des Biotin-UT2-Peptids führten wir einen Pulldown-Assay unter Verwendung der Membranfraktion von HEK293-Zellen durch, die UTS2R in Gegenwart oder Abwesenheit von Remdesivir exprimierten (ergänzende Abbildung 1c). Unter den verschiedenen Arten von Magnetkügelchen, die wir getestet haben, zeigten Magnetkügelchen mit hydrophober Beschichtung die maximale Pulldown-Wirksamkeit bei geringer unspezifischer Bindung (ergänzende Abbildung 1d). Unter Verwendung des optimierten Protokolls stellten wir fest, dass Remdesivir und Uranid den Biotin-UT2-vermittelten UTS2R-Pulldown signifikant beeinträchtigten (Abb. 1d, e, ergänzende Abb. 1e). Diese Ergebnisse legen nahe, dass Remdesivir direkt mit UTS2R interagieren und dadurch die Biotin-UT2-UTS2R-Bindung stören kann.

Wir haben weiter untersucht, ob die Metaboliten von Remdesivir UTS2R aktivieren. GS-441524 und GS-704277, die Haupt- bzw. Nebenmetaboliten von Remdesivir6,27, zeigten keinen Einfluss auf die UTS2R-Aktivierung (Abb. 1a, ergänzende Abb. 1a). Um zu untersuchen, ob die McGuigan-Prodrug-Einheit für die UTS2R-Aktivierung von Remdesivir verantwortlich ist, haben wir Sofosbuvir (GS-7977), ein von der FDA zugelassenes Prodrug3 der McGuigan-Klasse, gegen UTS2R getestet. Sofosbuvir aktivierte UTS2R jedoch nicht (Abb. 1a, ergänzende Abb. 1a). Diese Ergebnisse legen nahe, dass sowohl die McGuigan-Prodrug-Einheit als auch die Nukleosidbase von Remdesivir zur Aktivierung des Rezeptors erforderlich sind.

UTS2R gehört zur GPCR-Familie der Klasse A29 und besteht aus den kanonischen 7 Transmembranhelices (TM), der amphipathischen Helix 8 am C-Terminus (H8), zwei antiparallelen β-Strängen in der extrazellulären Schleife 2, einem relativ kurzen N-Terminus Domäne mit zwei N-Glykosylierungsstellen und einem Palmitoylierungsanker am C-terminalen Schwanz (Abb. 2a oben). Remdesivir hingegen ist ein Analogon von Adenosin und einem Phosphoramidat-Prodrug der McGuigan-Klasse (Phenol und L-Alanin-Ethylbutylester), das die anionische Phosphateinheit auf Remdesivir maskiert und so die Arzneimittelabgabe verbessert. Um die molekulare Basis für die Ligand-Rezeptor-Bindung weiter aufzuklären, führten wir in silico ein strukturelles Docking von UTS2R in Gegenwart von Remdesivir durch (Abb. 2a unten). Unsere Analyse zeigte mehrere Aminosäurereste in der orthosterischen Tasche, die möglicherweise die Bindung an Remdesivir stabilisieren. Erstens bildet die Cyanogruppe des Nukleosuckers von Remdesivir eine Wasserstoffbrücke zum UTS2R-Rest T3047,42×41 (hochgestellte Zeichen kennzeichnen das generische GPCR-Nummerierungssystem30). Zweitens ist die Phenylgruppe der McGuigan-Prodrug-Einheit von Remdesivir mit N2977,35×34 verkappt. Schließlich bildet die Aminogruppe der Nukleobase von Remdesivir eine Wasserstoffbrücke mit M1343.36 am Boden der Tasche (NH···S-Wasserstoffbrücke31).

a Oberes Panel, Schema von UTS2R; Unteres Panel, Docking-Modell von UTS2R mit Remdesivir. Die AlphaFold-Struktur des menschlichen UTS2R ist als grüne Bänder dargestellt, wobei TM5 der Übersichtlichkeit halber weggelassen wurde. Remdesivir und ausgewählte Seitenketten des Rezeptors werden als Stäbchen dargestellt und sind grau bzw. grün gefärbt. Schwarze gestrichelte Linien zeigen Wasserstoffbrückenbindungen an. b, c Auswirkungen der angegebenen Mutationen auf die durch Remdesivir (b) oder UT2 (c) vermittelte Rezeptoraktivierung. Die y-Achse (⊿pEC50-Wert) stellt die relative Aktivierungsstärke jedes mutierten Rezeptors im Vergleich zum WT-Rezeptor dar. ⊿pEC50-Wert = pEC50-Mutante − pEC50 WT. Der ⊿pEC50-Grenzwert wurde auf –1 festgelegt, wie durch gestrichelte Linien angezeigt. Die EC50-Werte wurden durch den TGFα-Shedding-Assay bestimmt. **p < 0,01, ***p < 0,001 vs. WT durch einfaktorielle ANOVA, gefolgt von Dunnetts Mehrfachvergleichstest. Die Daten werden als Mittelwert ± SEM (n ≥ 3) angezeigt.

Um das Docking-Modell zu validieren, haben wir diese UTS2R-Reste (T3047.42×41, N2977.35×34 und M1343.36) zu anderen Aminosäuren mutiert und getestet, ob diese Mutationen die Remdesivir-vermittelte UTS2R-Aktivierung beeinflussen (Abb. 2b, c , Ergänzende Abb. 2a, b). Im Einklang mit der In-silico-Simulation hat die Mutation der drei Reste die Aktivierungskraft von Remdesivir gegenüber UTS2R fast vollständig aufgehoben, was darauf hindeutet, dass Remdesivir an mehreren Resten mit UTS2R in Kontakt treten muss, um eine stabile Bindung zu erreichen. Sowohl die Nukleosid- als auch die McGuigan-Einheit sind für die Rezeptorbindung essentiell, wobei N2977.35×34 mit der McGuigan-Einheit interagiert und M1343.36 und T3047.42×41 mit der Nukleosideinheit interagieren. Diese strukturelle Beobachtung erklärt, warum die Mutation einer einzelnen Aminosäure die Aktivität von Remdesivir gegenüber UTS2R deutlich verringert. Diese Erklärung wird weiter durch das Ergebnis gestützt, dass UTS2R nicht auf Remdesivir-Metaboliten reagiert, aus denen die McGuigan-Einheit metabolisch entfernt wird. Im Gegensatz dazu reduzierten diese Mutationen die UT2-vermittelte UTS2R-Aktivierung nur teilweise. Im Gegensatz zu diesen drei Resten haben wir festgestellt, dass D1303.32 eine hemmende Wirkung auf die Remdesivir-UTS2R-Bindung hat. Die D1303.32N-Mutation hob die UT2-vermittelte UTS2R-Aktivierung auf, regulierte jedoch die Remdesivir-vermittelte Rezeptoraktivierung deutlich hoch (Abb. 2b, c, ergänzende Abb. 2a, b). Gemäß dem Docking-Modell ist der D1303.32-Rest in der Nähe der Nukleobaseneinheit von Remdesivir lokalisiert (Abb. 2a). Wir spekulieren, dass die negative Ladung des D1303.32-Restes einen Elektronenabstoßungseffekt induzieren könnte32, der zu einer Destabilisierung der Wechselwirkung zwischen dem D1303.32-Rest und der Nukleobase führt. Diese Ergebnisse zeigen, dass die Remdesivir-vermittelte UTS2R-Aktivierung durch eine spezifische Bindung zwischen UTS2R und seiner McGuigan-Prodrug-Einheit und Nukleosidbase vermittelt wird, die sich von der von UTS2R und dem endogenen Liganden unterscheidet.

Um festzustellen, ob die Remdesivir-vermittelte UTS2R-Aktivierung die intrazelluläre Signaltransduktion induziert, stimulierten wir UTS2R-exprimierende HEK293-Zellen mit Remdesivir und untersuchten den Phosphorylierungsstatus der extrazellulären signalregulierten Kinase (ERK)1/2. Die Anwendung von Remdesivir über einen Zeitraum von bis zu 72 Stunden führte zu einer langanhaltenden und dosisabhängigen Phosphorylierung von ERK1/2 (Abb. 3a, ergänzende Abb. 3a). Wichtig ist, dass die Remdesivir-vermittelte ERK-Phosphorylierung durch den UTS2R-Antagonisten aufgehoben wurde (Abb. 3a, ergänzende Abb. 3a). Die durch Remdesivir induzierte Reaktion von ERK1/2 war ähnlich der durch UT2 induzierten (ergänzende Abbildung 3b).

a Serumarme HEK293-Zellen, die UTS2R überexprimieren, wurden mit den angegebenen Konzentrationen von Remdesivir 5 Minuten lang mit oder ohne Urantid, einem UTS2R-Antagonisten, stimuliert und die Lysate einer Western-Blot-Analyse unterzogen. Die Aktivierungsverhältnisse von ERK1 und ERK2 (pERK1/ERK1 und pERK2/ERK2) wurden mit auf das Fahrzeug normalisierten Daten berechnet. *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001, ****p < 0,0001 nach Tukeys Mehrfachvergleichstest. Die Daten werden als Mittelwert ± SEM (n = 3) dargestellt. b Links: Zeitliche Korrelation zwischen der Feldpotentialdauer und dem QT-Intervall im Oberflächen-EKG. Rechts: Schematische Darstellung der Multielektroden-Array-Plattform (MEA). c Repräsentative Feldpotentialwellenform in humanen induzierten pluripotenten Stammzellen-abgeleiteten Kardiomyozyten (hiPSC-CMs), die 72 Stunden lang mit 1 µM Remdesivir in Gegenwart oder Abwesenheit von Urantid behandelt wurden. d Wirkung von Remdesivir und Urantid auf die Feldpotentialverlängerung in hiPSC-CMs. *p < 0,05, **p < 0,01 durch Zwei-Wege-ANOVA, gefolgt von Šídáks Mehrfachvergleichstests. Die Daten werden als Mittelwert ± SEM (n = 3) dargestellt. e Perforierte Patch-Clamp zur Aufzeichnung spontaner Aktionspotentiale von hiPS-CMs in Current-Clamp-Modellen. Die hiPSC-CMs wurden 72 Stunden lang mit 10 µM Remdesivir in Gegenwart oder Abwesenheit von 50 µM Urantid behandelt. *p < 0,05 und **p < 0,01 gemäß Tukeys Mehrfachvergleichstest. Die Daten werden als Mittelwert ± SEM (n ≥ 3) dargestellt.

UT2 und sein Rezeptor UTS2R werden in Geweben häufig exprimiert, wobei die Expression in Herz-Kreislauf-Systemen relativ hoch ist (ergänzende Abbildungen 3c, d). Angeregt durch das kardiotoxische Potenzial von Remdesivir10,11,12,13 haben wir den Einfluss von Remdesivir auf die Funktionen von Kardiomyozyten untersucht. Wir untersuchten die Wirkung von Remdesivir auf das Feldpotential (FP) mithilfe von vom Menschen induzierten pluripotenten Kardiomyozyten aus Stammzellen (hiPSC-CMs)34, bei denen das Expressionsniveau von UTS2R mit dem des menschlichen Herzens vergleichbar ist (ergänzende Abbildung 3e). ). Die FP-Dauer (FPD) korreliert eng mit dem QT-Intervall im Elektrokardiogramm (EKG)35 (Abb. 3b links). Insbesondere wurde die Verlängerung des QT-Intervalls mit dem Auftreten schwerer und potenziell tödlicher Arrhythmien in Verbindung gebracht, und die QT-Verlängerung ist die Hauptursache für arzneimittelinduzierte kardiovaskuläre Toxizität36. Für die Beurteilung von FPD ist die Verwendung einer Multielektroden-Array-Plattform (MEA) allgemein anerkannt, da sie die Elektrophysiologie von Kardiomyozyten auf Zellpopulationsebene überwachen kann (Abb. 3b rechts)35. Eine MEA-Analyse ergab, dass mit Remdesivir behandelte hiPSC-CMs eine verlängerte FPD von 1,32 ± 1,38 % nach 24 Stunden, 5,60 ± 1,60 % nach 48 Stunden bzw. 15,57 ± 3,49 % nach 72 Stunden aufwiesen. Bemerkenswerterweise wurde die Verlängerung durch den UTS2R-Antagonisten signifikant unterdrückt (Abb. 3c, d). Tatsächlich zeigte die Anwendung des UTS2R-Antagonisten mit Remdesivir fast keine FPD-Verzögerung nach 24 Stunden (−1,71 ± 1,60 %) und 48 Stunden (−0,61 ± 0,11 %), während der Umkehreffekt immer noch signifikant war, aber nach 72 Stunden teilweise wurde (Abb . 3d).

Zusätzlich zur FPD untersuchten wir die QT-Verlängerung durch perforierte Patch-Clamp und zeichneten spontane Aktionspotentiale von hiPS-CMs auf. Wir haben die APD90 (Aktionspotentialdauer bei 90 % Repolarisation) gemessen. Remdesivir verlängerte die APD90 in hiPS-CMs signifikant, und diese Verlängerung wurde durch die Verabreichung von Urantid deutlich abgeschwächt (Abb. 3e). Somit verdeutlichen diese Ergebnisse einen bisher unbekannten Mechanismus der berichteten proarrhythmischen Risiken von Remdesivir11,12,13, der zumindest teilweise von UTS2R abhängt. Als nächstes untersuchten wir die Auswirkungen von Remdesivir auf die Herzkontraktilität. Zu diesem Zweck verwendeten wir neugeborene Rattenkardiomyozyten (NRCMs) und bewerteten die Kontraktionskraft. Unter einem konstanten Stimulationsprotokoll zeigten NRCMs mit chronischer Remdesivir-Behandlung eine verringerte Kontraktilität, die durch den UTS2R-Antagonisten deutlich abgeschwächt wurde (Abb. 4a).

a, b Links, repräsentative Wellenform der Kontraktilität unter Stimulation in neonatalen Ratten-Kardiomyozyten (NRCMs) mit 1 µM Remdesivir mit oder ohne Urantid oder b-Pertussis-Toxin (PTX), einem Gαi/o-Inhibitor, und YM-254890, einem Gαq/11 Inhibitor, nach 48 Stunden. Rechts, die Wirkung von Remdesivir mit einem Urantid oder b-PTX und YM-254890 auf die Kontraktilität unter Stimulation in NRCMs. **p < 0,01, ***p < 0,001, ****p < 0,0001 nach Tukeys Mehrfachvergleichstest. Die Daten werden als Mittelwert ± SEM (n = 3) dargestellt. c, d Repräsentativer Western Blot für die Phosphorylierung von c ERK1/2 und d Proteinkinase B (AKT). Serumarme HEK293-Zellen, die UTS2R überexprimierten, wurden 48 Stunden lang mit den angegebenen Remdesivir-Konzentrationen stimuliert. Zur Hemmung des Gi/o-Proteins wurden die Zellen mindestens 18 Stunden lang mit PTX bei 150 ng/ml inkubiert. Die Aktivierungsverhältnisse ERK1, ERK2 und AKT wurden mit auf das Fahrzeug normalisierten Daten berechnet. *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001 nach Tukeys Mehrfachvergleichstest. Die Daten werden als Mittelwert ± SEM (n = 3) angezeigt. e, f Die Auswirkungen von Remdesivir auf die Kontraktilität erwachsener Maus-Kardiomyozyten. Isolierte erwachsene Maus-Kardiomyozyten wurden 30 Minuten lang mit Remdesivir (10 µM) behandelt und die prozentuale Änderung der Zellfläche (e) und das Verhältnis der Kardiomyozytenverkürzung (f) wurden während der elektrischen Stimulation gemessen. ****p < 0,001 durch ungepaarten t-Test. Die Daten werden als Mittelwert ± SEM (insgesamt 54 Zellen von 3 Mäusen) angezeigt.

Heterotrimere G-Proteine, einschließlich Gαs, Gαi/o, Gαq/11 und Gα12/13, sind die nachgeschalteten Effektoren von GPCRs. Unter diesen ist die Gαi/o-Familie über die Modulation von Ionenkanälen an der Kontraktilität des Herzmuskels und der Herzfrequenz beteiligt37. Da UTS2R an Gαi/o und Gαq29 gekoppelt ist, wollten wir herausfinden, welches Gα-Protein an der Remdesivir-vermittelten Abnahme der Myokardkontraktion beteiligt ist. Der Gαi/o-Inhibitor Pertussistoxin (PTX), nicht jedoch der Gαq/11-Inhibitor YM-254890, blockierte die Wirkung von Remdesivir vollständig und stellte die Spitzenkontraktionen der NRCMs wieder her (Abb. 4b). Eine frühere Studie hat gezeigt, wie die Aktivierung von Gαi/o in NRCMs zur Freisetzung von Gβγ führt, das intrazellulär PI3K aktiviert, was zur Aktivierung von AKT und ERK1/238 führt. Im Einklang mit dieser Beobachtung reduzierte die Gαi/o-Hemmung die Remdesivir-induzierte Phosphorylierung von ERK1/2 und AKT (Abb. 4c, d). Diese Ergebnisse legen nahe, dass Remdesivir die Kontraktilität der Kardiomyozyten über den Gαi/o-abhängigen AKT/ERK-Signaltransduktionsweg verringert. Insgesamt deuten unsere Ergebnisse darauf hin, dass Remdesivir selbst als exogener Ligand von UTS2R fungieren kann. Darüber hinaus haben wir das proarrhythmische und negativ inotrope Potenzial von Remdesivir identifiziert, die beide UTS2R-abhängig sind.

Da neugeborene Kardiomyozyten nicht terminal differenziert sind, untersuchten wir die Wirkung von Remdesivir weiter auf reife Kardiomyozyten, die aus erwachsenen Mäuseherzen isoliert wurden (ergänzende Abbildung 3f). Die Kontraktion der Kardiomyozyten wurde unter Stimulationsbedingungen aufgezeichnet und der Grad der Kontraktion durch morphologische Analyse bewertet. Ähnlich wie bei neonatalen Kardiomyozyten beeinträchtigte Remdesivir die Kontraktion erwachsener Kardiomyozyten erheblich (Abb. 4e, f).

Eine frühere Studie deutete darauf hin, dass eine mitochondriale Dysfunktion eine mitochondriale Dysfunktion verursachen kann39, da die aktive Form von Remdesivir bei hoher Dosis eine hemmende Wirkung auf die mitochondriale RNA-Polymerase (mtRNAP) zeigt40. Die Behandlung mit Remdesivir in einer Konzentration von 10 μM, was der maximalen Plasmakonzentration nach der Verabreichung von Remdesivir beim Menschen entspricht 27 , hatte jedoch keinen Einfluss auf die Steady-State-Spiegel der Proteine ​​des mitochondrialen Atmungskomplexes (ergänzende Abbildung 3g, h).

Um den Einfluss der genetischen Varianz auf die Anfälligkeit für Remdesivir-UTS2R-Signale beim Menschen zu verstehen, extrahieren wir Informationen zu Einzelnukleotidvarianten (SNV) aus einer Genomdatenbank, die das 14KJPN Genome Reference Panel enthält, bei dem es sich um ein groß angelegtes bevölkerungsbasiertes Genom handelt Datenbank, die aus der DNA-Sequenz von 14.000 japanischen Individuen41 erstellt wurde, gefolgt von einem Funktionstest zur Rezeptoraktivierung. Im UTS2R-Locus werden insgesamt 2178 Varianten gemeldet, davon 139 Varianten Missense-Varianten (Supplementary Data 2). Eine beträchtliche Anzahl der im 14KJPN aufgeführten Missense-SNVs wird auch in der gnomAD-Datenbank (https://gnomad.broadinstitute.org) gemeldet, die SNVs aus breiteren ethnischen Gruppen enthält.

Dementsprechend haben wir 110 Missense-Mutanten erzeugt, die den menschlichen SNVs im UTS2R-Gen entsprechen. Wir haben 29 Missense-Mutationen in der 5′-Region von UTS2R ausgeschlossen, da der Konfidenzwert für die strukturelle Vorhersage des N-Terminus relativ niedrig war. Unter den 110 Missense-SNVs zeigten 44 SNVs eine Abnahme der Empfindlichkeit gegenüber Remdesivir im Vergleich zum WT-Rezeptor (⊿pEC50 <–0,3, was einem mehr als zweifachen EC50-Anstieg im Vergleich zum WT-Rezeptor entspricht; Abb. 5a, oberes Feld). Unterdessen zeigten 47 SNVs eine verringerte Empfindlichkeit gegenüber UT2 im Vergleich zum WT-Rezeptor, wobei 18 SNVs mit denen überlappten, die eine verringerte Empfindlichkeit gegenüber Remdesivir zeigten (Abb. 5a, unteres Feld, ergänzende Abb. 4a). Bemerkenswerterweise haben wir vier Missense-SNVs (G681.49C, D1303.32G, V15934.54M und A249ICL3G) gefunden, die die Rezeptorempfindlichkeit gegenüber Remdesivir im Vergleich zum WT-Rezeptor erhöhen können (⊿pEC50 > 0,3, was einem < 0,5-fachen entspricht). EC50-Abnahme im Vergleich zum WT-Rezeptor; Abb. 5a–c). Darüber hinaus zeigten unter diesen vier Remdesivir-empfindlichen UTS2R-SNVs mit Funktionsgewinn die Mutanten G681.48C und D1303.32G umgekehrt eine Abnahme der Empfindlichkeit gegenüber UT2, während die Mutanten V15934.54M und A249ICL3 einen moderaten oder unbedeutenden Anstieg zeigten UT2-Empfindlichkeit (⊿pEC50 <0,3; Abb. 5c, ergänzende Abb. 4a). Insgesamt deuten die Ergebnisse darauf hin, dass Personen mit einer G681.49C-, D1303.32G-, V15934.54M- oder A249ICL3G-Mutation im UTS2R-Gen empfindlich auf Remdesivir reagieren, was sie möglicherweise anfälliger für UTS2R-vermittelte Kardiotoxizität macht, obwohl die Allelfrequenzen der Funktionsgewinnvarianten sind gering (ergänzende Abbildung 4b).

a Auswirkungen von 110 Missense-SNVs aus dem UTS2R-Gen auf die (obere Tafel) Remdesivir-vermittelte und (untere Tafel) UT2-vermittelte Rezeptoraktivierung, gemessen mit dem TGFα-Shedding-Assay. Die y-Achse (⊿pEC50-Wert) stellt die relative Aktivierungsstärke jedes mutierten Rezeptors im Vergleich zum WT-Rezeptor dar. Der ⊿pEC50-Grenzwert wurde auf –1 festgelegt, wie durch gestrichelte Linien angezeigt. Hellblaue Banden stellen den Bereich von −0,3 < ⊿pEC50 < 0,3 dar, was dem Bereich einer 0,5-fachen bis 2-fachen (weniger als 2-fachen) Änderung der EC50 des mutierten Rezeptors im Vergleich zum WT-Rezeptor entspricht. Alle Experimente wurden dreifach durchgeführt und die Daten werden als Mittelwerte ausgedrückt. b Schlangendiagramm von UTS2R, das die Orte von Mutationen und ihre Auswirkungen auf die Wirksamkeit von Remdesivir zeigt (modifiziert von www.gpcrdb.org). c Auswirkungen der ausgewählten Mutationen auf die (links) Remdesivir-vermittelte und (rechts) UT2-vermittelte Rezeptoraktivierung. EC50-Werte werden durch den TGFα-Shedding-Assay bestimmt. „ns“ p > 0,05 und ****p < 0,0001 vs. WT durch einfache ANOVA, gefolgt von Dunnetts Mehrfachvergleichstests. Die Daten werden als Mittelwert ± SEM (n ≥ 3) angezeigt.

Nach Abschluss der Adaptive COVID-19 Treatment Trial 1 (ACTT-1)7, die die Überlegenheit von Remdesivir gegenüber Placebo bei der Verbesserung der Genesungszeit bei hospitalisierten COVID-19-Patienten zeigte, ist Remdesivir eines der am häufigsten verschriebenen Medikamente für hospitalisierte Patienten für eine COVID-19-Infektion. Wichtig ist, dass die ACTT-1-Forscher berichteten, dass 0,2 % der Patienten, die Remdesivir erhielten, aber nicht die Patienten, die Placebo erhielten, Arrhythmien aufwiesen (außer Vorhofflimmern, supraventrikulärer Tachykardie, ventrikulärer Tachykardie und Kammerflimmern), obwohl diese kardiovaskulären Wirkungen nicht als nachteilig angesehen wurden Auswirkungen. Allerdings könnte der Prozentsatz der Patienten, die an Herzrhythmusstörungen leiden, unterschätzt werden, da frühe klinische Studien nicht ausreichend aussagekräftig sind, um ungewöhnliche unerwünschte Ereignisse zu erkennen42. Tatsächlich wurde in einer großen retrospektiven Pharmakovigilanz-Kohortenstudie, die Krankenakten aus mehr als 130 Ländern und 20 Millionen Patienten nutzte, berichtet, dass Herzstillstand, Bradykardie und Hypotonie mit der Einnahme von Remdesivir verbunden sind10. Die Erhöhung der Plasma-Remdesivir-Konzentration ist mit einer Verlängerung der FP-Dauer mit verringerten Na+-Peak-Amplituden und spontanen Schlagraten verbunden, was möglicherweise zu einer Verlängerung des QT-Intervalls und einer Torsade de Point43,44 führen kann. Wichtig ist, dass die kardialen Nebenwirkungen offenbar gezielt durch Remdesivir verursacht werden, da berichtet wurde, dass sie innerhalb von 24–48 Stunden nach Absetzen von Remdesivir abklingen45,46. Bisher ist der genaue Mechanismus, der den kardialen Nebenwirkungen von Remdesivir zugrunde liegt, unklar, es gibt keine Möglichkeit vorherzusagen, welche Bevölkerungsgruppen anfällig für seine kardialen Nebenwirkungen sind, und es gibt keine spezifische Behandlung für die Kardiotoxizität. Daher besteht ein dringender Bedarf zu verstehen, wie Remdesivir eine Herzfunktionsstörung hervorruft.

Mithilfe einer unvoreingenommenen und groß angelegten GPCR-Screening-Strategie haben wir festgestellt, dass Remdesivir, nicht jedoch Molnupiravir und Favipiravir, UTS2R selektiv aktivieren kann. Die Wechselwirkung zwischen Remdesivir und UTS2R wurde durch den kompetitiven Bindungstest unter Verwendung des Biotin-UT2-Peptids weiter gestützt. Interessanterweise wird UTS2R im Herzgewebe, einschließlich Kardiomyozyten, stark exprimiert. Die Aktivierung von UTS2R durch Urotensin-II (UT2), den endogenen Liganden von UTS2R, wurde mit Herzfunktionsstörungen in Verbindung gebracht. Beispielsweise sind der Plasmaspiegel von UT2 und der Expressionsgrad von UTS2R in Kardiomyozyten bei Patienten mit Herzinsuffizienz im Endstadium erhöht47. Im Einklang mit diesen früheren Studien stellten wir fest, dass die Aktivierung von UTS2R durch Remdesivir in einer Konzentration von 1 μM elektrische Anomalien und eine Beeinträchtigung der Kontraktionskraft in kultivierten Kardiomyozyten hervorrief, die beide den berichteten kardialen Nebenwirkungen beim Menschen ähneln. Darüber hinaus wurden diese Nebenwirkungen wirksam blockiert, indem UTS2R antagonisiert oder seine Downstream-Signalisierung gehemmt wurde. Klinisch wird Remdesivir in einer Dosis von einmal 200 mg intravenös verabreicht, gefolgt von 100 mg täglich für insgesamt 5–10 Tage bei Erwachsenen und Kindern ≥ 40 kg. Die geschätzte maximale Plasmakonzentration von Remdesivir beträgt bei gesunden Erwachsenen 9,03 μM und kann bei Patienten mit eingeschränkter Nieren- oder Leberfunktion aufgrund seiner renalen und biliären Ausscheidung höher sein48. Unsere Ergebnisse legen nahe, dass die klinische Dosierung von Remdesivir ausreicht, um UTS2R zu aktivieren, und dass bei Patienten mit eingeschränkter Nieren- oder Leberfunktion möglicherweise ein hohes Risiko für unerwünschte Ereignisse besteht, die über die Remdesivir-UTS2R-Achse vermittelt werden. Insbesondere zeigte unser GPCR-Test deutlich, dass Remdesivir keine Wirkung auf Adenosinrezeptoren hat, deren Aktivierung sich auch auf die Herzfunktionen auswirken kann. Daher ist wahrscheinlich die Aktivierung von UTS2R für die kardialen Nebenwirkungen verantwortlich.

Ein wichtiges Ergebnis dieser Studie ist, dass SNVs in der kodierenden Region von UTS2R große Auswirkungen auf dessen Reaktion auf Remdesivir haben. Dieses Ergebnis steht im Einklang mit früheren Studien, die zeigen, dass SNVs in GPCR-Genen mit der Pathophysiologie verschiedener Krankheiten, einschließlich CV-Erkrankungen, verbunden sind und die therapeutischen Ergebnisse beeinflussen49. Während 40 % der SNVs in UTS2R (44/110) eine mindestens zweifache Verringerung der Wirksamkeit gegenüber Remdesivir im Vergleich zum WT-Rezeptor zeigten, zeigten 56 % (62/110) keine bemerkenswerte Veränderung (im Bereich von 0,5-fach bis). 2-fache Veränderung) identifizierten wir vier Gain-of-Function-SNVs, die als Reaktion auf Remdesivir einen mehr als zweifachen Anstieg zeigten. Bemerkenswert ist, dass D1303.32G eine Variante derselben Aminosäure war, für die wir mittels In-silico-Modellierung eine Gain-of-Function-Mutation (D1303.32N) identifizierten, was auf die Bedeutung des D1303.32-Restes für die Remdesivir-Erkennung hinweist.

Die Aktivierung von GPCR induziert häufig die Rekrutierung von β-Arrestin an den Rezeptor, gefolgt von der Internalisierung des Rezeptors in das intrazelluläre Kompartiment. Diese Internalisierung beendet die GPCR-Aktivierung und fördert sekundäre Signalwege50. Interessanterweise induzierte die Remdesivir-vermittelte UTS2R-Aktivierung im Gegensatz zum endogenen Liganden UT2, der effektiv die Rekrutierung von β-Arrestin induziert (Abb. 1c)51, keine Rekrutierung von β-Arrestin. Unsere Ergebnisse legen daher nahe, dass Remdesivir ein G-Protein-abhängiger Ligand ist (Abb. 1c, ergänzende Abb. 1b). Eine solche voreingenommene Aktivierung von UTS2R durch Remdesivir kann einen erheblichen Einfluss auf die Herzfunktion haben, und zwar in einer Weise, die eine längere Aktivierung von UTS2R ohne β-Arrestin-vermittelte Abschaltung und damit eine Übertreibung der nachgeschalteten Signalübertragung und verstärkte kardiotoxische Wirkungen ermöglicht. Es ist jedoch auch denkbar, dass die mäßige Wirksamkeit von Remdesivir den Nachweis einer β-Arrestin-Reaktion behindert haben könnte. Weitere Studien mit einer neuen Methode zur empfindlichen Erkennung der β-Arrestin-Reaktion sind erforderlich, um den Bias-Effekt von Remdesivir zu bewerten.

Bei der Ligandenbindung initiieren GPCRs, einschließlich UTS2R, eine Konformationsänderung, die die Aktivierung heterotrimerer G-Proteine ​​​​und die Dissoziation von Gα- und Gβγ-Untereinheitskomplexen induziert. Zu den Gα-Proteinen gehören die Proteine ​​Gαs, Gαi/o, Gαq/11 und Gα12/13, die für die nachgeschaltete Signaltransduktion verantwortlich sind. Mitglieder der Gαi/o-Familie sind weit verbreitet, auch im Herzsystem, wo sie stark exprimiert werden und über die Modulation von Ionenkanälen die Kontraktilität des Myokards und die Herzfrequenz regulieren37. Beispielsweise wird die Ruheherzfrequenz durch cholinerge Signale gesteuert, die über muskarinische M2-Gαi-gekoppelte Rezeptoren vermittelt werden. Diese Effekte entstehen durch Hemmung der Adenylylcyclase (AC) und durch Gβγ-Hemmung eines Kaliumkanals im Sinusknoten. Der Transduktionsmechanismus von UTS2R ist die Kopplung und Aktivierung von Gαi/o sowie Gαq29, was damit übereinstimmt, dass die UT2-UTS2R-Achse über komplexe Signalwege sowohl physiologisch als auch pathologisch an der CV-Regulation beteiligt ist. Unsere Ergebnisse unter Verwendung von NRCMs zeigten deutlich, dass die Remdesivir-vermittelte Abnahme der Myokardkontraktion von Gαi/o abhängt, nicht jedoch von Gαq/11 (Abb. 4b). Da NRCMs dem Phänotyp von Vorhofmyozyten ähneln52, weist die Abnahme der Myokardkontraktilität bei konstanter Stimulation durch Remdesivir auf eine Beeinträchtigung der Kalziumverarbeitung hin53, was mit der Verlangsamung der Herzfrequenz, einer charakteristischen kardiovaskulären Nebenwirkung von Remdesivir, vereinbar ist10. Darüber hinaus haben wir gezeigt, dass Remdesivir die Kontraktilität erwachsener Kardiomyozyten signifikant beeinträchtigt (Abb. 4e, f).

Trotz der Entdeckung, dass Remdesivir UTS2R aktivieren und Kardiotoxizität verursachen kann, ist das Fehlen klinischer Beweise eine wesentliche Einschränkung dieser Studie. Da jedoch die Allelfrequenzen der Gain-of-Function-Varianten niedrig sind (ergänzende Abbildung 4b) und der Einsatz von Remdesivir aufgrund der jüngsten Prävalenz der Omicron-COVID-19-Variante mit ihren milderen Symptomen voraussichtlich zurückgehen wird, ist ein großer Rückgang zu verzeichnen Die Durchführung einer groß angelegten klinischen Studie zum Zusammenhang zwischen Remdesivir-Empfindlichkeit und genomischer Varianz ist eine Herausforderung. Darüber hinaus haben wir die genauen molekularen Mechanismen, die das UTS2R-abhängige proarrhythmische Risiko von Remdesivir induzieren, nicht ermittelt. Mögliche Erklärungen sind die gestörte Regulation der Genexpression oder der Transport von ERG-Kaliumkanälen, die für die elektrische Aktivität im Herzen unerlässlich sind54. Alternativ stehen die chronischen und kumulativen kardiotoxischen Wirkungen der Remdesivir-UTS2R-Achse im Einklang mit einer nachgelagerten Auswirkung auf Translation und Transkription. Obwohl wir die Möglichkeit nicht ausschließen, dass Remdesivir den mitochondrialen Stoffwechsel durch UTS2R-Signalübertragung beeinflussen könnte (ergänzende Abbildung 3f), deuten die aktuellen Daten darauf hin, dass die Remdesivir-UTS2R-Achse das wichtigste Off-Target von Remdesivir ist.

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass dies unseres Wissens nach der erste Bericht ist, der zeigt, dass Remdesivir ein selektiver Agonist von UTS2R ist und dass die durch Remdesivir vermittelte UTS2R-Aktivierung der medikamentenvermittelten Kardiotoxizität zugrunde liegt. Darüber hinaus haben wir herausgefunden, dass bestimmte SNVs in UTS2R die Empfindlichkeit gegenüber Remdesivir erhöhen können. Somit liefert diese Studie mechanistische Einblicke in Remdesivir-vermittelte kardiale Nebenwirkungen und die therapeutische Möglichkeit, aversive Ereignisse in der Zukunft zu verhindern.

Das übergeordnete Ziel dieser Studie bestand darin, die molekularen Mechanismen der Remdesivir-bedingten Kardiotoxizität in der Anti-COVID-19-Therapie zu untersuchen. Wir führten zunächst das GPCR-Screening unter Verwendung der wichtigsten Anti-COVID-19-Medikamente als Liganden durch (n = 3 pro GPCR). Wir validierten die Ergebnisse des GPCR-Screenings durch Konzentrations-Wirkungs-Analyse und bestimmten die EC50- und Emax-Werte von Remdesivir gegenüber UTS2R (n = 16). Wir haben auch eine Docking-Simulation mit AlphaFold durchgeführt und die wichtigsten Aminosäurereste bestimmt, die für die Remdesivir-UTS2R-Bindung essentiell sind, wie durch eine Mutagenesestudie gezeigt wurde (n ≥ 3). Als nächstes untersuchten wir das kardiotoxische Potenzial von Remdesivir. Unter Verwendung von hiPS-abgeleiteten Kardiomyozyten fanden wir heraus, dass das proarrhythmische Risiko von Remdesivir größtenteils durch UTS2R vermittelt wird (n = 3). Darüber hinaus haben wir mithilfe von NRCMs gezeigt, dass die Abnahme der Kontraktionskraft durch Remdesivir durch die UTS2R-Gαi/o-Achse (n = 3) vermittelt wird. Schließlich wurden die Auswirkungen von SNVs im UTS2R-Gen auf die Remdesivir-vermittelte Rezeptoraktivierung mithilfe eines GPCR-Assays (n = 3 pro SNV) bewertet.

Remdesivir (GS-5734), GS-441524 und Sofosbuvir (GS-7977) wurden von Selleck Chemicals gekauft. Favipiravir wurde von Tokyo Chemical Industry gekauft. Fibronektin wurde von Sigma-Aldrich bezogen. Alle anderen Reagenzien waren von analytischer Qualität und wurden aus kommerziellen Quellen bezogen.

Um in UTS2R nach SNVs zu suchen, verwendeten wir eine öffentliche Datenbank mit 14.000 gesunden japanischen Personen namens 14KJPN, die von der Tohoku Medical Megabank Organization (ToMMo, https://jmorp.megabank.tohoku.ac.jp/)41 der Universität Tohoku veröffentlicht wurde deckt Variantenfrequenzdaten ab.

Um die Aktivierung des GPCR zu messen, wurde ein Transforming Growth Factor-α (TGFα)-Shedding-Assay durchgeführt26. Kurz gesagt, HEK293A-Zellen wurden in eine Kulturplatte mit 12 Vertiefungen ausgesät. Insgesamt wurden 348 pCAG-Plasmide hergestellt, die für einen GPCR ohne Tag kodieren, einschließlich des UTS2R-Konstrukts (Supplementary Data 1). Die UTS2R-Mutanten, darunter 110 Missense-Mutanten, die den menschlichen SNVs im UTS2R-Gen entsprechen, wurden durch Einführung von Einzelpunktmutationen mithilfe eines KOD-Plus-Mutagenese-Kits erzeugt. Die Zellen wurden unter Verwendung eines Polyethylenimin (PEI)-Reagens (2,5 µl von 1 mg/ml pro Vertiefung im Folgenden; Polysciences) mit diesen UTS2R-Plasmiden (100 ng pro Vertiefung im Folgenden) zusammen mit den Plasmiden, die mit alkalischer Phosphatase (AP) markiertes TGFα codieren, transfiziert ( AP-TGFα; 250 ng). Sofern nicht anders angegeben, wurden UTS2R-Aktivierungstests mit endogenem G-Protein durchgeführt. Chimäre Gα-Untereinheitsproteine ​​(Mischung aus Gαq/s, Gαq/i1, Gαq/i3, Gαq/o, Gαq/z, Gαq/12, Gαq/13 und Gα16; jeweils 10 ng) wurden für das erste Screening von 348 GPCRs verwendet (Abb. 1a). Nach einer 24-stündigen Kultur wurden die transfizierten Zellen geerntet und durch Zentrifugation gesammelt. Die Zellen wurden in Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) mit 5 mM HEPES (pH 7,4) suspendiert und in eine 96-Well-Platte ausgesät. Nach einer 30-minütigen Inkubation wurde die Testverbindung zu den Zellen gegeben. Nach einstündiger Inkubation wurden die konditionierten Medien auf eine leere 96-Well-Platte übertragen. Die AP-Reaktionslösung (eine Mischung aus 10 mM p-Nitrophenylphosphat (p-NPP), 120 mM Tris-HCl (pH 9,5), 40 mM NaCl und 10 mM MgCl2) wurde zu Platten gegeben, die Zellen und konditionierte Medien enthielten. Die Absorption bei einer Wellenlänge von 405 nm wurde mit einem Mikroplattenlesegerät (Molecular Devices) vor und nach einstündiger Inkubation der Platten bei Raumtemperatur gemessen. Die verbindungsinduzierte AP-TGFα-Freisetzung wurde berechnet, indem das spontane AP-TGFα-Freisetzungssignal vom verbindungsinduzierten AP-TGFα-Freisetzungssignal subtrahiert wurde, und die Prozentsätze wurden mithilfe der Prism 9-Software (GraphPad Prism) an eine sigmoidale Konzentrations-Reaktions-Kurve mit vier Parametern angepasst. , und die EC50- und Emax-Werte wurden ermittelt.

Es wurde ein NanoBiT-Enzymkomplementations-basierter β-Arrestin-Rekrutierungstest durchgeführt55. Kurz gesagt, HEK293A-Zellen wurden in einer Kulturplatte mit 6 Vertiefungen ausgesät und unter Verwendung eines PEI-Reagens (im Folgenden 5 µl von 1 mg/ml pro Vertiefung) mit einer Plasmidmischung bestehend aus 500 ng ssHA-FLAG-UTS2R-SmBiT-Konstrukt (N -terminale Hämagglutinin-Signalsequenz, gefolgt von einem FLAG-Epitop-Tag, plus C-terminales SmBiT mit einem flexiblen 15-Aminosäuren-Linker), 100 ng LgBiT-β-Arrestin-Konstrukt (N-terminales LgBiT mit einem flexiblen 15-Aminosäuren-Linker) und 400 ng leeres Plasmid. Nach 24-stündiger Kultur wurden die transfizierten Zellen geerntet, in 2 ml Testpuffer (Hanks' Balanced Salt Solution, enthaltend 5 mM HEPES (pH 7,4) und 0,01 % Rinderserumalbumin) suspendiert und in eine 96-Well-Platte ausgesät ein Volumen von 80 µl pro Vertiefung. Den Zellplatten wurde Coelenterazin (20 µl von 50 µM, verdünnt im Testpuffer) zugesetzt, gefolgt von einer Inkubation bei Raumtemperatur für 2 Stunden im Dunkeln. Nach der Messung der Grundlumineszenz mit einem Spectra Max L Microplate Reader (Molecular Devices) wurde Remdesivir oder UT2 (20 µl der 6-fachen Konzentration) hinzugefügt. Die Lumineszenz wurde alle 20 s nach Zugabe der Verbindung gemessen. Das durchschnittliche Lumineszenzsignal über 5–10 Minuten wurde auf einen Anfangswert normalisiert. Die Fold-Change-Werte wurden weiter auf die des mit Vehikel behandelten Zustands normiert und an eine sigmoidale Konzentrations-Reaktions-Kurve mit vier Parametern angepasst, um EC50-Werte mithilfe der Prism 9-Software zu erhalten.

Zum Affinitäts-Pulldown von UTS2R wurde ein UT2-Peptid mit einem N-terminalen Biotin-Tag und einem GSSG-Spacer synthetisiert (Peptide Institute, INC)28. HEK293-Zellen wurden mit dem für FLAG-UTS2R kodierenden Plasmid transfiziert und ihnen wurde vor dem Experimentieren 6 Stunden lang das Serum entzogen. Die Zellen wurden zweimal mit eiskaltem PBS gewaschen. Der Zellplatte wurde eine hypotonische Lösung (50 mM HEPES, pH 7,5 mit Proteaseinhibitor-Cocktails) zugesetzt und die Zellen wurden durch Abschaben geerntet. Die Zellen wurden mit einem Dounce-Homogenisator (IKA EUROSTAR 20 digital) bei 2.000 U/min für 20 Hübe bei 4 °C homogenisiert und mit einem Geweberiss (Qiagen) für 5 s bei 4 °C weiter homogenisiert. Das Homogenat wurde 10 Minuten lang bei 4 °C und 800 xg zentrifugiert, um intakte Zellen und den Zellkern zu entfernen. Der Überstand wurde 30 Minuten lang bei 4 °C (CP80NX, Himac) mit 30.000 × g weiter zentrifugiert. Das resultierende Pellet wurde als rohe Membranfraktion verwendet und in hyperosmotischer Lösung (50 mM HEPES, pH 7,5, 250 mM NaCl, 2 mM EDTA mit Proteaseinhibitor) suspendiert.

Anschließend wurde die rohe Membransuspension in Gegenwart oder Abwesenheit von Remdesivir 1 Stunde lang inkubiert, gefolgt von einer Inkubation mit Biotin-UT2 über Nacht. Der Biotin-UT2-gebundene UTS2R-Komplex wurde unter Verwendung eines hyperosmotischen Puffers, der ein Detergens (N-Dodecyl-β-D-maltopyranosid; DDM, 5 × CMC) enthielt, solubilisiert und unter Verwendung von Streptavidin-Magnetkügelchen heruntergezogen. Die für das Experiment geeigneten Perlen wurden aus 5 Typen ausgewählt (Ergänzende Abbildung 1d, Dynabeads Streptavidin Trial Kit, Thermo Fisher und Streptavidin-Magnetperlen, NEB) und mit SDS-Puffer denaturiert. Die Lysate wurden dann einer SDS-PAGE unterzogen, gefolgt von einem Western Blot unter Verwendung eines Anti-FLAG-Antikörpers zum Nachweis von FLAG-UTS2R (monoklonaler Sigma M2-Antikörper, 1:2000).

Eine menschliche UTS2R-Struktur wurde aus der AlphaFold Protein Structure Database56,57 (AlphaFold Monomer v2.0) durch Trimmen der deckelähnlichen N-Terminus-Region (1–42) mit einem niedrigen pLDDT-Score erstellt. Mit dem Programm Reduce58 wurden dem beschnittenen Rezeptor Wasserstoffatome hinzugefügt. Remdesivir wurde von AutoDockFR59 mit 50 genetischen Algorithmusentwicklungen und maximal 2.500.000 Bewertungen in der orthosterischen Tasche des Rezeptors angedockt. Docking-Posen wurden am 2-Å-Grenzwert geclustert, und die obersten fünf Cluster wurden anhand des Kriteriums der Wasserstoffbrückenbindung zwischen dem Rezeptor und Remdesivir untersucht. Strukturen wurden mit CueMol und PyMOL (Schrödinger, Inc.) visualisiert und analysiert. Die in dieser Studie verwendeten Dateien wurden bei Zenodo hinterlegt.

Für Blots von pERK, ERK, pAKT, AKT und β-Actin wurden UTS2R-transfizierte und serumarme HEK293A-Zellen mit 0,1 oder 1 μM Remdesivir oder 10 oder 100 nM UT2 stimuliert. Vor der Stimulation mit diesen Verbindungen wurden die Zellen 30 Minuten lang mit Urantid (Peptide Institute) bei 100 nM (zur UTS2R-Hemmung) oder mit 150 ng/ml Pertussis-Toxin (PTX; Wako) über Nacht (zur Gαi/o-Hemmung) inkubiert. Für Blots mitochondrialer Proteine ​​(Gesamt-OXPHOS, MT-COI, TFAM und VDAC) wurden 1 oder 10 μM Remdesivir oder 1 oder 10 μM GS-441524 48 Stunden lang zu UTS2R-transfizierten HEK293A-Zellen gegeben. Ganzzelllysate wurden in RIPA-Lysepuffer (Thermo Fischer Scientific) hergestellt, der Proteaseinhibitoren (Thermo Fischer Scientific) und Phosphataseinhibitoren (Nacalai Tesque) enthielt. Zelllysate wurden beschallt und durch Zentrifugation geklärt. Die Proteinkonzentrationen wurden mit dem BCA Protein Assay Kit (Pierce) gemessen und auf 1 mg/ml eingestellt, und für jedes Experiment wurden 10 μg Proteine ​​einem Western Blot unterzogen. Die Proben wurden mithilfe von SDS-Polyacrylamidgelen aufgetrennt und auf Polyvinylidendifluorid (PVDF)-Membranen übertragen. Die Blots wurden 1 Stunde lang mit 5 % fettfreier Milch in TBS-T (Tris-gepufferte Kochsalzlösung mit 0,1 % Tween-20) blockiert und dann mit verschiedenen Primärantikörpern sondiert. Die verwendeten Primärantikörper und Arbeitsverdünnungen waren wie folgt: pERK (AB_331646), 1:2000; ERK (AB_330744), 1:2000; pAKT (AB_329825), 1:1000; AKT (AB_329827), 1:1000; βactin (AB_10697039), 1:10000; Gesamt-OXPHOS (AB_2756818), 1:10000; MTCO1 (AB_2084810), 1:2000; TFAM (AB_10841294), 1:1000; VDAC (AB_2272627), 1:1000. Zielantigene wurden mit geeigneten HRP-konjugierten Sekundärantikörpern (Cell Signaling) inkubiert und durch ein ECL-Substrat (GE Healthcare) sichtbar gemacht. Die phosphorylierten Proteinspiegel wurden gegenüber den Gesamtspiegeln des Zielproteins normalisiert (Abb. 3a und 4c, d, ergänzende Abb. 3a, b). Zur Messung mitochondrialer Proteine ​​(ergänzende Abbildung 3g) wurden die OXPHOS-Untereinheiten VDAC, MTCO1 und TFAM durch spezifische Antikörper auf verschiedenen PVDF-Membranen nachgewiesen. Die Proteingehalte der OXPHOS-Untereinheiten, MTCO1 und TFAM wurden auf den Wert von VDAC normalisiert.

Um die humane UTS2R (hUTS2R)-mRNA-Expression in normalen erwachsenen menschlichen Geweben zu beurteilen, wurden kommerziell erhältliche cDNAs aus verschiedenen menschlichen Geweben von TaKaRa erworben (detaillierte Probeninformationen finden Sie in den Ergänzungsdaten 3) und 2 ng cDNA wurden einer quantitativen PCR unterzogen (qPCR)-Analyse (Rotor-Gene Q, Qiagen), wie von den Herstellern empfohlen. Um die mRNA-Expression von Maus-UTS2R (mUTS2R) in normalen erwachsenen Mausgeweben zu beurteilen, wurden männliche C57BL/6J-Mäuse von Japan Clea gekauft und RNA aus mehreren Geweben isoliert. RNA-Proben wurden revers in cDNA transkribiert und einer qPCR-Analyse unterzogen. Die für die relative Quantifizierung verwendeten Primer sind in den Zusatzdaten 4 aufgeführt. Die Expressionsniveaus von hUTS2R und mUTS2R wurden auf die Housekeeping-Gene von G3PDH bzw. 18 s-rRNA normalisiert.

Vom Menschen induzierte pluripotente Stammzellen-abgeleitete Kardiomyozyten (hiPSC-CMs) wurden von Fujifilm Cellular Dynamics, Inc. (CDI; iCell Cardiomyozyten 2.0) erworben. Um die Sonde (MED-PG515A, Alpha MED Sciences) vorzubereiten, wurden die Aufzeichnungsbereiche mit Fibronektin beschichtet und in Dulbeccos phosphatgepufferter Kochsalzlösung gelöst, um eine 50 µg/ml-Lösung zu erzeugen. Der Aufzeichnungsbereich wurde mit 1–2 µL Fibronektinlösung bedeckt und die Sonden wurden mindestens 1 Stunde lang bei 37 °C inkubiert. Die Zellen wurden aufgetaut und in iCell Cardiomyocytes Plating Medium (CDI) suspendiert und mit einer Dichte von 3,5 × 104 Zellen in einem 2 µL Plattierungsmedium auf die Sonden ausplattiert. Die Zellen wurden 3–4 Stunden lang bei 37 °C in 5 % CO2 inkubiert, bevor jede Sonde mit 1 ml iCell-Kardiomyozyten-Erhaltungsmedium (CDI) gefüllt wurde, das als Kulturmedium verwendet wurde. Das Medium wurde alle 2–3 Tage gewechselt, wobei die Zellen 5–14 Tage lang in den Sonden kultiviert wurden, um eine Schicht aus Kardiomyozyten mit spontaner und synchroner elektrischer Aktivität zu erhalten.

Die FP-Aufzeichnung wurde durchgeführt35,60. Vor der Messung der FPs wurden iCell-Kardiomyozytenblätter mindestens 4 Stunden lang in einem frischen Kulturmedium unter Verwendung eines 5 % CO2-Inkubators bei 37 °C äquilibriert. Nach der Äquilibrierung wurden die Sonden in das Multi-Elektroden-Array-System (MEA) (MED64, Alpha med Scientific) übertragen und in einer angefeuchteten 5 % CO2-Atmosphäre inkubiert. Die Stabilität und Konstanz der Wellenformen wurde durch Überwachung der Signale über mindestens 30 Minuten bestätigt. Sobald die FPs einen stabilen Zustand erreichten, wurden sie 10 Minuten lang zu Beginn und dann 24, 48 und 72 Stunden nach der medikamentösen Behandlung aufgezeichnet. Die Stammlösungen der Arzneimittel wurden in Dimethylsulfoxid (DMSO) oder destilliertem Wasser mit einer 1000-fachen Zielkonzentration hergestellt. Die Stammlösung wurde in einem Kulturmedium auf eine Endkonzentration von 0,1 % DMSO verdünnt.

Die FP-Dauer (FPD) wurde als die Dauer vom ersten bis zum zweiten Höhepunkt im FP35 definiert. Die FPD wurde hinsichtlich der Schlagfrequenz (Inter-Spike-Intervall (ISI)) mit der Formel von Fridericia (Gleichung 1) korrigiert, die in dieser Studie die primäre Korrekturmethode war:

Die ISI- und FPD-Werte wurden aus den letzten 30 Schlägen oder 30 Schlägen zu Zeitpunkten gemittelt, die einen stabilen ISI und FPD aufwiesen.

Die perforierte Patch-Clamp-Technik wurde zur Aufzeichnung spontaner Aktionspotentiale in Current-Clamp-Modellen von hiPS-CMs bei 25 °C unter Verwendung eines EPC-10 Patch-Clamp-Verstärkers (HEKA, Lambrecht, Deutschland)61 verwendet. Die hiPS-CMs erzeugen typischerweise eine spontane Automatik in normaler Tyrode-Lösung. Spontane Aktionspotentiale wurden mit einer feuerpolierten Patchpipette (Widerstand 2,0–4,0 MΩ) aufgezeichnet, die mit einer Pipettenlösung gefüllt war, die 70 mM Kaliumaspartat, 50 mM KCl, 10 mM KH2PO4, 1 mM MgSO4, 3 mM Adenosintriphosphat (ATP) enthielt. (Dinatriumsalz; Sigma Chemical Company, St. Louis), 5 mM EGTA, 5 mM HEPES und 0,1 mM Li2-Guanosintriphosphat (GTP) (Sigma Chemical Company) (pH-Wert mit KOH auf 7,2 eingestellt). Amphotericin B (Wako Pure Chemical Industries) wurde der Pipettenlösung in einer Konzentration von 100 mg/ml zugesetzt. Das in 35-mm-Kulturschalen ausplattierte Glasdeckglas (3 × 5 mm2), das hiPS-CMs enthielt, wurde in eine Aufzeichnungskammer mit normaler Tyrode-Lösung gegeben.“

Neonatale Rattenkardiomyozyten (NRCMs) wurden an den postnatalen Tagen 1–362 aus Sprague-Dawley-Rattenwelpen (Japan SLC Inc.) isoliert. Die Ventrikel der Welpen wurden nach terminaler Anästhesie (1,5 % Sevofluran-Inhalation) und Euthanasie durch Zervixluxation präpariert und auf Eis zerkleinert. Das zerkleinerte Gewebe wurde über Nacht bei 4 °C in 0,05 % Trypsin-EDTA (Gibco) vorverdaut und dann 30 Minuten lang in 1 mg/ml Kollagenase Typ 2 (Worthington) in PBS bei 37 °C unter Schütteln des Kolbens (125 U/min) verdaut ). Die dissoziierten Zellen wurden durch ein Zellsieb (70 μm, Falcon) filtriert und 2 Minuten lang bei 180 × g zentrifugiert. Nach dem Entfernen des Überstands wurden die Zellpellets in Dulbeccos modifiziertem Eagle-Medium 12 (DMEM), ergänzt mit 10 % FBS und 1 % Penicillin und Streptomycin, in einer 10-cm-Kulturschale resuspendiert. Die Zellen wurden 90 Minuten lang bei 37 °C in einer feuchten Atmosphäre (5 % CO2, 95 % Luft) inkubiert. Schwimmende NRCMs wurden gesammelt und auf mit Matrigel beschichteten Kulturschalen ausplattiert. Nach 24 Stunden wurde das Kulturmedium auf serumfreies DMEM umgestellt und vor den Experimenten mehr als 2 Tage lang inkubiert. Alle Tierversuche wurden von den Ethikkommissionen der National Institutes of Natural Sciences oder dem Animal Care and Use Committee der Kyushu-Universität überprüft und genehmigt. Alle gemeldeten Verfahren entsprechen dem NIH Guide for the Care and Use of Laboratory Animals.

NRCMs (4 × 105 Zellen/Vertiefung) wurden auf 3,5-cm-Schalen mit Glasboden in serumfreiem DMEM ausgesät. Die Zellen wurden 48 Stunden lang bei 37 °C und 5 % CO2 mit Remdesivir (1 μM) behandelt. Gleichzeitig wurde Urantid (100 nM) zugegeben. Pertussis-Toxin (PTX; 150 ng/ml) wurde 18 Stunden vor der Zugabe von Remdesivir behandelt, und YM-254890 (1 μM) wurde 30 Minuten vor der Zugabe von Remdesivir behandelt. Mikroskopische Bilder von NRCMs wurden 13 s lang unter Stimulationsbedingungen aufgezeichnet. Die Stimulation von NRCM wurde mit 4 V pro Sekunde und einer Frequenz von 10 ms unter Verwendung eines Elektrostimulators (NIHON KOHDEN, SEN-3301) stimuliert. Bilddaten wurden mit einem BZ-X800-Mikroskop (Keyence) mit sechs Bildern pro Sekunde erfasst und mit der Fiji-Software63 analysiert.

C57BL/6J-Mäuse zur Isolierung erwachsener Maus-Kardiomyozyten wurden von Japan SLC Inc. (Shizuoka, Japan) gekauft. Es wurde eine Isolierung adulter ventrikulärer Kardiomyozyten von Mäusen durchgeführt64. Männliche Mäuse wurden durch Inhalation mit Isofluran betäubt. Das Herz wurde schnell herausgeschnitten und die Aorta mit einer kleinen Gefäßklemme abgeklemmt. Das Herz wurde antegrad mit Isolationspuffer (weniger als 3 ml) perfundiert, der 130 mM NaCl, 5,4 mM KCl, 0,5 mM MgCl2, 0,33 mM NaH2PO4, 25 mM HEPES, 22 mM Glucose und 50 μU/ml Rinderinsulin (Sigma) enthielt ( pH 7,4, eingestellt mit NaOH), ergänzt mit 0,4 mM EGTA, gefolgt von der Perfusion von Enzymlösung (10 ml) (Isolationspuffer mit 1 mg/ml Kollagenase Typ 2 (Worthington), 0,06 mg/ml Trypsin (Sigma), 0,06 mg /ml Protease (Sigma) und 0,3 mM CaCl2). Danach wurde die LV-Kammer entfernt und in einer Enzymlösung, die 0,2 % Rinderserumalbumin (BSA) und 0,7 mM CaCl2 enthielt, in kleine Stücke geschnitten. Die Gewebe-Zell-Suspension wurde durch ein Zellsieb (100 μm, Falcon) filtriert und 3 min bei 50 × g zentrifugiert. Nach Entfernen des Überstands wurde das Zellpellet in Isolationspuffer, ergänzt mit 0,2 % BSA und 1,2 mM CaCl2, resuspendiert und 7 Minuten lang bei 37 °C inkubiert. Nach der Zentrifugation (50 × g, 3 min) wurden die Zellen in Tyrodes Lösung A (enthaltend 140 mM NaCl, 5,4 mM KCl, 1,8 mM CaCl2, 0,5 mM MgCl2, 0,33 mM NaH2PO4, 5,0 mM HEPES und 5,5 mM Glucose) resuspendiert ( pH 7,4)) ergänzt mit 0,2 % BSA. Die Zellen wurden auf mit Matrigel (Corning) beschichteten 35-mm-Glasbodenschalen (IWAKI) ausgesät und 30 Minuten bei 37 ° C inkubiert. Die Zellen wurden innerhalb von 1–6 Stunden nach der Isolierung verwendet.

Isolierte erwachsene Maus-Kardiomyozyten wurden 30 Minuten lang bei 37 °C mit Remdesivir (10 μM) behandelt. Mikroskopische Bilder von Kardiomyozyten wurden 13 Sekunden lang unter Stimulationsbedingungen aufgezeichnet. Die Stimulation der Kardiomyozyten wurde mit 30 V pro Sekunde und einer Frequenz von 10 ms unter Verwendung eines Elektrostimulators (NIHON KOHDEN, SEN-3301) stimuliert. Bilddaten wurden mit Fiji-Software analysiert.

Statistische Analysen wurden mit Prism Software (GraphPad) durchgeführt und die Methoden sind in den Legenden der Abbildungen beschrieben. Symbole sind Mittelwerte und Fehlerbalken geben den Standardfehler des Mittelwerts (SEM) an. Für jede Abbildung werden repräsentative Ergebnisse aus mindestens drei unabhängigen Experimenten angezeigt, sofern in den Abbildungslegenden nichts anderes angegeben ist.

Weitere Informationen zum Forschungsdesign finden Sie in der mit diesem Artikel verlinkten Nature Portfolio Reporting Summary.

Alle Daten sind im Haupttext oder den ergänzenden Materialien verfügbar. Die den Zahlen zugrunde liegenden Quelldaten finden Sie in den Zusatzdaten 1. Unbeschnittene Blots sind in der Zusatzabbildung 5 dargestellt. Molekulare Docking-Simulationsdateien wurden bei Zenodo hinterlegt.

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Wir sind dankbar für Anregungen und technische Unterstützung von allen Mitgliedern der Abteilung für Modomics-Biologie und -Medizin der Tohoku-Universität. Wir danken Y. Takahata und H. Miyamoto für die technische Unterstützung und Natalie D. DeWitt für die kritische Lektüre und Sprachbearbeitung. Diese Arbeit wurde durch Mittel von JSPS KAKENHI unterstützt (Zuschussnummern JP20K18371, JP22H04628 und JP22H02813 für AO, JP21H05269 und JP22H02772 für MN, JP21H04791 und JP21H051130 für AI, JP21H02659 und JP21). H05265 an FYW und JP21H02634 an Y. Kanda. Dieses Werk wurde auch von AMED unterstützt (Grant-Nr. JP21mk0101189 an Y. Kanda, JP22zf0127007 an AI, 21he2302008j0002 an FYW, BINDS JP22ama121031 an MN und JP20am0101095 an AI, LEAP JP20gm0010004 an AI), FOREST von JST (Zuschussnummern JPMJFR220K an AO, JPMJFR215T zu AI, JPMJFR205Y zu FYW), Moonshot R&D JPMJMS2023 von JST zu AI, CREST JPMJCR2024 (20348438) von JST zu MN, ERATO JPMJER2002 von JST zu FYW, Daiichi Sankyo Foundation of Life Science zu AI, Takeda Science Foundation zu AO und AI , Uehara Memorial Foundation für AO und AI, Inamori Foundation für AO, die Mitsubishi Foundation für AO, die Terumo Life Science Foundation für AO und die Naito Foundation für AO

Diese Autoren haben gleichermaßen beigetragen: Akiko Ogawa, Seiya Ohira.

Abteilung für Modomics-Biologie und -Medizin, Institut für Entwicklung, Altern und Krebs (IDAC), Tohoku-Universität, Sendai, Miyagi, 980-8575, Japan

Akiko Ogawa, Seiya Ohira und Fan-Yan Wei

Graduate School of Medicine, Tohoku-Universität, Sendai, Miyagi, 980-8575, Japan

Seiya Ohira

Abteilung für Physiologie, Graduate School of Pharmaceutical Sciences, Kyushu University, Fukuoka, 812-8582, Japan

Yuri Kato, Xinya Mi, Yukina Ishii und Motohiro Nishida

Labor für molekulare und zelluläre Biochemie, Graduiertenschule für Pharmazeutische Wissenschaften, Tohoku-Universität, 6-3, Aoba, Aramaki, Aoba-ku, Sendai, Miyagi, 980-8578, Japan

Tatsuya Ikuta und Asuka Inoue

Abteilung für Pharmakologie, National Institute of Health Sciences, Kanagawa, 210-9501, Japan

Shota Yanagida & Yasunari Kanda

Abteilung für Pharmazeutische Wissenschaften, Graduiertenschule für Medizin, Zahnmedizin und Pharmazeutische Wissenschaften, Universität Okayama, Okayama, 700-8530, Japan

Shota Yanagida

National Institute for Physiological Sciences und Exploratory Research Center on Life and Living Systems, National Institutes of Natural Sciences, Okazaki, 444-8787, Japan

Motohiro Nishida

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Die Autoren bestätigen ihren Beitrag zum Papier wie folgt: Studienkonzeptualisierung und -design: AO, MN, AI und FYW; Datenerfassung: AO, SO, Y. Kato, TI, SY, XM, YI und AI; Analyse und Interpretation der Ergebnisse: AO, Y. Kato, TI, SY, XM, Y. Kanda, MN, AI und FYW Entwurfspapiervorbereitung: AO, Y. Kato, TI, SY, XM, AI, FYW Projektüberwachung: Y. Kanda, MN, AI, FYW Alle Autoren überprüften die Ergebnisse und genehmigten die endgültige Version des Papiers.

Korrespondenz mit Motohiro Nishida, Asuka Inoue oder Fan-Yan Wei.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

Communications Biology dankt Dipayan Chaudhuri und den anderen anonymen Gutachtern für ihren Beitrag zum Peer-Review dieser Arbeit. Hauptredakteur: George Inglis.

Anmerkung des Herausgebers Springer Nature bleibt hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten neutral.

Open Access Dieser Artikel ist unter einer Creative Commons Attribution 4.0 International License lizenziert, die die Nutzung, Weitergabe, Anpassung, Verbreitung und Reproduktion in jedem Medium oder Format erlaubt, sofern Sie den/die ursprünglichen Autor(en) und die Quelle angemessen angeben. Geben Sie einen Link zur Creative Commons-Lizenz an und geben Sie an, ob Änderungen vorgenommen wurden. Die Bilder oder anderes Material Dritter in diesem Artikel sind in der Creative Commons-Lizenz des Artikels enthalten, sofern in der Quellenangabe für das Material nichts anderes angegeben ist. Wenn Material nicht in der Creative-Commons-Lizenz des Artikels enthalten ist und Ihre beabsichtigte Nutzung nicht durch gesetzliche Vorschriften zulässig ist oder über die zulässige Nutzung hinausgeht, müssen Sie die Genehmigung direkt vom Urheberrechtsinhaber einholen. Um eine Kopie dieser Lizenz anzuzeigen, besuchen Sie http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.

Nachdrucke und Genehmigungen

Ogawa, A., Ohira, S., Kato, Y. et al. Die Aktivierung des Urotensin-II-Rezeptors durch Remdesivir führt zu einer Funktionsstörung der Kardiomyozyten. Commun Biol 6, 511 (2023). https://doi.org/10.1038/s42003-023-04888-x

Zitat herunterladen

Eingegangen: 10. November 2022

Angenommen: 28. April 2023

Veröffentlicht: 12. Mai 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s42003-023-04888-x

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