Die Exposition gegenüber anionischem Nanoplastik führt zu einer Undichtigkeit des Endothels

Aug 13, 2023

Nature Communications Band 13, Artikelnummer: 4757 (2022) Diesen Artikel zitieren

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Die weltweite Produktion von Kunststoffen hat maßgeblich zum Fortschritt der modernen Gesellschaft beigetragen, während die zunehmende Ansammlung von Kunststoffen auf Mülldeponien, in Ozeanen und allem, was dazwischen liegt, zu einem großen Stressfaktor für die ökologische Nachhaltigkeit, das Klima und möglicherweise auch die menschliche Gesundheit geworden ist. Während mechanische und chemische Kräfte von Mensch und Natur Kunststoffe letztendlich abbauen oder recyceln können, ist unser Verständnis der biologischen Fingerabdrücke von Kunststoffen, insbesondere von Nanoplastik, nach wie vor dürftig. Hier berichten wir über ein Phänomen im Zusammenhang mit den nanoplastischen Formen von anionischem Polystyrol und Poly(methylmethacrylat), bei dem ihre Einführung die vaskulären endothelialen Cadherin-Verbindungen dosisabhängig störte, wie durch konfokale Fluoreszenzmikroskopie, Signalwege und Molekulardynamiksimulationen gezeigt wurde sowie Ex-vivo- und In-vivo-Assays mit Tiermodellsystemen. Insgesamt deuten unsere Ergebnisse darauf hin, dass die durch Nanoplastik induzierte Gefäßpermeabilität in erster Linie biophysikalisch-biochemischer Natur ist und nicht mit zytotoxischen Ereignissen wie der Produktion reaktiver Sauerstoffspezies, Autophagie und Apoptose korreliert. Dieser aufgedeckte Weg des parazellulären Transports hat weitreichende Möglichkeiten für die Untersuchung des Verhaltens und der biologischen Auswirkungen von Nanokunststoffen eröffnet, die entscheidende Erkenntnisse für die Steuerung von Innovationen hin zu einer nachhaltigen Kunststoffindustrie und Umweltsanierung liefern könnten.

Mikro- und Nanoplastik sind Derivate des physikalischen, chemischen und biologischen Abbaus von Kunststoffen, die aus Industrie- und Forschungseinrichtungen oder als Nebenprodukte von Gebrauchsgegenständen wie Kleidung, Shampoos und Plastikteebeuteln in die Umwelt gelangen1. Da die weltweite Produktion von Kunststoffen im letzten Jahrhundert stetig zugenommen hat und allein im Jahr 2018 359 Millionen Tonnen erreichte2, ist es für den Schutz von entscheidender Bedeutung, die schädlichen biologischen Auswirkungen dieser künstlichen Materialien3, insbesondere in ihren mikro- und nanoplastischen Formen, zu verstehen und zu mildern der menschlichen Gesundheit und der ökologischen Nachhaltigkeit bei gleichzeitiger Wahrung der modernen Lebensweise.

Spuren von Kunststoffen wurden in tierischen und menschlichen Organen durch Einatmen, Verschlucken und dermale Exposition gefunden, was auf ihre Verbreitung in Luft, Wasser und Boden zurückzuführen ist4,5. Nanokunststoffe unterscheiden sich von ihren mikroskopisch kleinen und ausführlicher untersuchten Gegenstücken hinsichtlich Oberfläche pro Volumen und Toxizitätsprofil und können das Wachstum, die Fortpflanzung und den Stoffwechsel von Tieren beeinträchtigen6,7,8,9 und das Immunsystem schwächen, indem sie die Zytokinsekretion, Apoptose und den Stress des endoplasmatischen Retikulums erhöhen und oxidativer Stress10,11,12,13.

Kürzlich wurde berichtet, dass anionische anorganische Nanopartikel wie TiO2, SiO2, Gold und Nanodiamanten in einem bestimmten Größenbereich (d. h. <100 nm) die vaskulären endothelialen Cadherin-Verbindungen (VE-Cadherin) stören und vorübergehende Mikrometer erzeugen können -große physikalische Öffnungen in endothelialen Monoschichten14,15. Dieses als Nanomaterial-induzierte endotheliale Leckage (NanoEL) bezeichnete Phänomen hat erhebliche Auswirkungen auf die Nanotoxikologie sowie die Nanomedizin, wo Nanostrukturen dazu dienen, Medikamente abzugeben oder Gewebeanomalien über ihren Gefäßkreislauf zu erkennen16, was ihre Translokation durch die Blut-Hirn-Schranke beinhaltet ( BBB) zeitweise. In dieser Studie berichten wir über ein biologisches Phänomen im Zusammenhang mit der Exposition gegenüber Nanoplastik in Form von Endothelleckagen in Endothelzellen der menschlichen Nabelschnurvene (HUVECs), die durch die Nanomaterialien hervorgerufen werden. Dieser Befund ist insofern überraschend, als (1) Nanokunststoffe polymere Materialien sind, von denen nicht bekannt ist, dass sie NanoEL16 induzieren, und (2) die Dichten der Nanokunststoffe, d. h. ∼1,05 g/m3 für Polystyrol und ∼1,18 g/m3 für Poly(methylmethacrylat) (PMMA) liegen deutlich unter dem Grenzwert von 1,72 g/m3, der für NanoEL-fähige anorganische Nanopartikel ermittelt wurde17. Insbesondere untersuchten wir die molekularen Mechanismen des VE-Cadherin-Dimer-Aufbruchs durch Polystyrol- und PMMA-Nanoplastiken mithilfe von Molekulardynamiksimulationen und dokumentierten darüber hinaus endotheliale Undichtigkeiten ex vivo mit Kaninchen- und Schweinevenen und in vivo mit Mäusen, die den Nanoplastiken ausgesetzt waren. In dieser Studie wurde die Gefäßpermeabilität als Mechanismus für den parazellulären Transport von Nanoplastik in Betracht gezogen und damit eine entscheidende Wissenslücke in unserem Bestreben, das biologische Verhalten und Schicksal der in der Ökosphäre vorkommenden Kunststoffe zu verstehen, geschlossen.

Die Morphologie und der hydrodynamische Durchmesser des Polystyrol (PS)-Nanoplastiks wurden durch Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) und dynamische Lichtstreuung (DLS) charakterisiert. Wie in Abb. 1a, b und der ergänzenden Abb. 1 dargestellt, waren die PS-Kügelchen monodispers und hatten eine durchschnittliche Größe von 21,2 ± 3,5 nm in Wasser und 26,2 ± 4,6 nm in Endothelzellmedium (ECM), wie durch TEM angezeigt. Im Vergleich dazu wies das PS-Nanoplastik eine hydrodynamische Größe von 62 ± 5,0 nm in H2O und 72 ± 2,0 nm in ECM auf, wie durch DLS bestimmt, was auf einen gewissen Grad an Agglomeration zurückzuführen ist. Dementsprechend änderte sich das ζ-Potential des Nanoplastiks von –35,4 ± 1,9 mV in H2O auf –7,5 ± 0,5 mV in ECM (Ergänzungstabelle 1). Darüber hinaus zeigte die Analyse der Röntgenphotoelektronenspektroskopie (XPS) das Vorhandensein von Carboxylen auf dem Nanokunststoff (Abb. 1c). Die Toxizität des Nanoplastiks wurde durch ein In-vitro-Cell Counting Kit-8 (CCK 8), reaktive Sauerstoffspezies (ROS) und Zellmortalitätstests weiter quantifiziert, wobei HUVECs im Laufe der Zeit unterschiedlichen Konzentrationen des Nanoplastiks ausgesetzt wurden (Abb. 1d, e und ergänzende Abbildung 2). HUVECs mit beeinträchtigter DNA-Integrität und/oder Membranen wurden durch Propidiumiodid (PI)-Färbung mit einer 22-stündigen Behandlung angezeigt (Abb. 1d und ergänzende Abb. 2a), und bei einer Inkubationszeit von bis zu 10 Stunden trat für alle Nanoplastikkonzentrationen kein offensichtlicher Zelltod auf angewandt. Bei PS-Nanoplastik von 0,5 mg/ml kam es nach 22 Stunden zu einer Schrumpfung und Verformung der Zellen, während bei PS-Konzentrationen von 0,05 bis 0,25 mg/ml keine signifikanten Veränderungen der Zelllebensfähigkeit oder Membranschäden beobachtet wurden. Bei kürzeren Behandlungsdauern wurde die Lebensfähigkeit der Zellen durch PS-Nanoplastik bei 0,05 und 0,5 mg/ml innerhalb von 1 Stunde nach der Exposition nicht beeinträchtigt (Abb. 1e), jedoch korrelierte die ROS-Produktion positiv mit der Nanoplastik-Konzentration und -Zeit. Insbesondere wurden ROS bei niedrigen Nanoplastikkonzentrationen (0, 05 und 0, 1 mg / ml) über 1 Stunde beobachtet (ergänzende Abbildung 2b, c). Die Internalisierung von PS-Nanoplastik in HUVECs wurde mit zunehmender Inkubationszeit und -dosis verstärkt (Abb. 1f und ergänzende Abb. 3). Darüber hinaus haben wir untersucht, wie PS-Nanoplastik den Zelltod auslöst. Autophagie ist ein Selbstverdauungsprozess18, der sowohl am Zelltod als auch am Überleben beteiligt ist19. Es wurde gezeigt, dass die lipidierte Form der Mikrotubuli-assoziierten Protein-Leichtkette 3 (LC3), LC3-II, ein Autophagosomenmarker ist, und die Bildungs- oder Umsatzrate von LC3-II wird als Indikator für die Autophagieaktivität verwendet20. Wir fanden heraus, dass 0,05 mg/ml PS-Nanoplastik die Umwandlung von LC3-II in HUVECs nach 1 und 3 Stunden nicht steigerte, aber das Expressionsniveau von LC3-II nach 6 Stunden signifikant hochregulierte. Darüber hinaus konnte in Gegenwart von 0,5 mg/ml PS-Nanoplastik in nur 1 Stunde eine reichliche Expression von LC3-II nachgewiesen werden (Abb. 1g). Darüber hinaus induzierte PS-Nanoplastik Autophagie und Apoptose, indem es den PI3K/AKT-Signalweg in HUVECs nach 6 Stunden hemmte (Ergänzende Abbildungen 4 und 5). Insbesondere zeigten Western Blots, dass die autophagiebezogenen Proteine ​​Beclin1, p62 und Atg5 sowie das proapoptotische Protein Bax in HUVECs dosisabhängig signifikant erhöht waren, während das antiapoptotische Protein Bcl-2 in HUVECs signifikant verringert war. Die Ergebnisse der Genexpression und der Proteinexpression stimmten gut überein (Ergänzende Abbildungen 4 und 5). Wenn HUVECs 6 Stunden lang 0,05 oder 0,5 mg/ml PS-Nanoplastik ausgesetzt wurden, wurden atrophische Kerne und die Bildung apoptotischer Körper beobachtet (ergänzende Abbildung 6).

a, b TEM-Bildgebung von Polystyrol (PS)-Nanoplastik in Milli-Q-Wasser und ihrer entsprechenden Größenverteilung (n = 341 untersuchte Nanopartikel). Maßstabsleiste: 50 nm. c Funktionelle Gruppen von PS-Nanoplastik wurden durch Röntgenphotoelektronenspektroskopie (XPS)-Analyse bestimmt. Der dominierende Peak bei 284,83 eV entstand aus der C-C-Bindung, und die anderen Peaks bei 286,34 eV und 289,28 eV wurden der C-O- bzw. O=C-O-Bindung zugeschrieben. d Toxizitäten von HUVECs bei Exposition gegenüber unterschiedlichen Konzentrationen von PS-Nanoplastik nach 22 Stunden. Mit PI gefärbte tote Zellen wurden im roten Fluoreszenzkanal sichtbar (n = 3 biologische Replikate). Maßstabsbalken: 200 μm. e Die Lebensfähigkeit der Zellen mit PS-Nanoplastik bei 0,05 und 0,5 mg/ml wurde durch einen CCK8-Assay zu verschiedenen Zeiten (1, 3 und 6 Stunden) gemessen. Als Positivkontrolle wurde H2O2 (200 μM) verwendet. Die statistische Analyse wurde mittels einer einfaktoriellen ANOVA und anschließenden Tukey-Mehrfachvergleichstests durchgeführt. P-Werte im Vergleich zur Kontrolle in jeder Gruppe wurden in das Panel eingefügt. f Bewertung der Zellassoziation für verschiedene Konzentrationen von PS-Nanoplastik nach 1, 3 und 6 Stunden. Die grüne Fluoreszenz von Nanoplastik wurde mittels Durchflusszytometrie gemessen. Die Daten werden als Mittelwert ± SD (n = 3) ausgedrückt. Die statistische Analyse erfolgte mittels einer Zwei-Wege-ANOVA und anschließenden Tukey-Mehrfachvergleichstests. Die abgeleiteten P-Werte wurden in das Panel eingefügt. g Western Blot und semiquantitative Analyse des Expressionsniveaus der Mikrotubuli-assoziierten Protein-Leichtkette 3-II/I (LC3-II/I). HUVECs wurden für unterschiedliche Zeiten (1, 3 und 6 Stunden) PS-Nanoplastik (0,05 und 0,5 mg/ml) ausgesetzt. Als Positivkontrolle wurde Rapamycin (1 μM) mit 6-stündiger Behandlung verwendet. Die Proteingehalte wurden durch Vergleich mit β-Aktin standardisiert. Die Daten werden als Mittelwert ± SD ausgedrückt. Es wurden biologisch unabhängige Proben verwendet (n = 3). Die statistische Analyse wurde mittels Zwei-Wege-ANOVA und anschließenden Tukey-Mehrfachvergleichstests durchgeführt. Die abgeleiteten P-Werte wurden in das Panel eingefügt. Quelldaten werden als Quelldatendatei bereitgestellt.

Anionische anorganische Nanopartikel können zu den adhärenten Verbindungen zwischen Endothelzellen wandern und diese zerstören, um NanoEL21 zu induzieren. Interessanterweise beobachteten wir NanoEL in HUVECs in Gegenwart von polymerem PS-Nanoplastik. Wir postulierten, dass Nanoplastik die adhärenten Verbindungen zerstören und weiter zu einer Undichtigkeit des Endothels führen könnte (Abb. 2a). Um das Auftreten einer Endothelleckage zu bestätigen, führten wir einen Transwell-Assay mit einer Fluoreszenzsonde, Fluoresceinisothiocyanat-konjugiertem Dextran (FITC-Dextran), durch, wobei eine intakte HUVECs-Monoschicht verschiedenen Konzentrationen von PS-Nanoplastik ausgesetzt wurde (Abb. 2b). Eine erhebliche Leckage wurde beobachtet, wenn die Zellen innerhalb einer Stunde nach der Exposition mit 0,5 mg/ml des Nanoplastiks behandelt wurden. Als die Behandlungsdauer auf 6 Stunden anstieg, beobachteten wir das Auftreten von Endothelleckagen bei allen Konzentrationen des Nanoplastiks. Anschließend verwendeten wir eine Immunfluoreszenzfärbung, um die Störung der adhärenten Verbindungen in den Endothelbarrieren sichtbar zu machen, wobei zwei repräsentative Konzentrationen von PS-Nanoplastik bei 0,05 und 0,5 mg/ml auf HUVECs aufgetragen wurden und 0,5 mM EDTA als Positivkontrolle verwendet wurden (Abb. 2c, Ergänzende Abbildungen 7 und 8). Nach 6 Stunden wurden große Lücken für 0,05 und 0,5 mg/ml des Nanoplastiks beobachtet. Morphologische Veränderungen und Integritätsstörungen von VE-Cadherin in HUVECs waren im Vergleich zur Kontrolle nach 3 und 6 Stunden erkennbar. Das Ausmaß der Endothelleckage wurde durch eine Lückenflächenanalyse mit ImageJ bestimmt (Abb. 2d und ergänzende Abb. 7)21. Die abgeleiteten Prozentsätze der Lückenbereiche bestätigten Daten aus dem Transwell-Assay, bei dem die endotheliale Undichtigkeit im Laufe der Zeit bei PS-Nanoplastik von 0,05 und 0,5 mg/ml ausgeprägter war. Das Ausmaß der Endothelleckage zeigte nach 6 Stunden einen deutlichen Anstieg im Vergleich zu 1- und 3-stündigen Inkubationen. Gleichzeitig deutete die Änderung der Fluoreszenzintensität der Aktinfilamente auf eine Reorganisation des Aktinnetzwerks des Zytoskeletts in Verbindung mit dem Endothel-Leakiness-Phänomen bei 3 und 6 Stunden Exposition des Nanoplastiks bei 0,05 mg/ml und 1, 3, 6 Stunden Exposition des Nanoplastiks hin bei jeweils 0,5 mg/ml (Abb. 2e). Darüber hinaus wurde ein VE-Cadherin-Protein-Pulldown-Assay durchgeführt, um zu untersuchen, ob PS-Nanoplastik die adhärenten Verbindungen direkt binden und zerstören kann. Nach unterschiedlicher Exposition gegenüber PS-Nanoplastik in unterschiedlichen Konzentrationen und für unterschiedliche Dauer wurden die gesamten Zellen lysiert und gleichzeitig PS-Nanoplastik mit den dazugehörigen Proteinen in den Kulturmedien durch Zentrifugation abgebaut. Wie in Abb. 2f und der ergänzenden Abb. 9 gezeigt, wurde das homophile VE-Cadherin der adhärenten Verbindungen dosisabhängig durch PS-Nanoplastik nach unten gezogen, und bei 0,5 mg/d wurde ein Anstieg der an PS gebundenen VE-Cadherine beobachtet. mL als 0,05 mg/mL, wohingegen die Menge an VE-Cadherinen, die durch PS-Nanoplastik abgebaut wurde, nicht durch die Expositionsdauer beeinflusst wurde. Zusätzlich wurde einem unbehandelten Zelllysat (Post-Lyse, P) PS-Nanoplastik in einer Menge von 0,05 und 0,5 mg/ml zugesetzt, wodurch keine nachweisbaren VE-Cadherine abgebaut wurden. Die Interpretation des spezifischen Ergebnisses zeigte, dass PS-Nanoplastik an VE-Cadherinen innerhalb der Adherens-Verbindungen und nicht im Zustand des Lysepuffers gebunden war, was darauf hindeutet, dass eine intakte Adherens-Verbindung erforderlich war, damit PS-Nanoplastik an VE-Cadherin binden konnte. Andererseits gab es in Gegenwart von Protein A/G-Magnetkügelchen (A) nach Zelllyse ohne PS-Nanoplastik keine Pull-Down-VE-Cadherine. Ganzzelllysate zeigten in den verschiedenen Gruppen eine ähnliche Expression von VE-Cadherin, was darauf hindeutet, dass PS-Nanoplastik die zelluläre VE-Cadherin-Expression weder transkriptionell noch posttranslational beeinflusste.

a Veranschaulichte Wechselwirkung zwischen adhärenten Verbindungen und Polystyrol (PS)-Nanoplastik. Die Integrität der HUVECs-Monoschicht wurde durch das PS-Nanoplastik aufgrund seiner Wechselwirkung mit VE-Cadherin gestört. b Der Transwell-Assay zeigte eine Dosis- und Zeitabhängigkeit der Undichtigkeit der Endothelzellbarrieren. Die Daten werden als Mittelwert ± SD (n = 3 biologisch unabhängige Proben) ausgedrückt. Die statistische Analyse wurde mittels einer einfaktoriellen ANOVA und anschließenden Tukey-Mehrfachvergleichstests durchgeführt. Die abgeleiteten P-Werte im Vergleich zur Kontrolle in jeder Gruppe wurden in das Panel eingefügt. c Konfokale Fluoreszenzmikroskopie beobachtete endotheliale Undichtigkeiten in Gegenwart unterschiedlicher Konzentrationen von PS-Nanoplastik (0,05 und 0,5 mg/ml) nach 1, 3 und 6 Stunden Exposition (n = 3 biologische Replikate). VE-Cadherine waren rot gefärbt. Die weißen Pfeile zeigen PS-induzierte Lücken zwischen HUVECs an. Maßstabsbalken: 20 μm. d Die semiquantitative Analyse des Lückenbereichs wurde mit der ImageJ-Software anhand der Bilder aus Panel c durchgeführt. Die Daten werden als Mittelwert ± SD ausgedrückt (n = 3 biologisch unabhängige Experimente). Die statistische Analyse wurde mittels Zwei-Wege-ANOVA und anschließenden Tukey-Mehrfachvergleichstests durchgeführt. Die abgeleiteten P-Werte im Vergleich zur Kontrolle wurden in das Panel eingefügt. Die Aktinintensität wurde mit der ImageJ-Software entsprechend den Bildern in der ergänzenden Abbildung 7 analysiert. Aktinfilamente wurden mit Phalloidin-iFluor 488 gefärbt. Die Daten werden als Mittelwert ± SD ausgedrückt (n = 3 biologisch unabhängige Experimente). Die statistische Analyse wurde mittels Zwei-Wege-ANOVA und anschließenden Tukey-Mehrfachvergleichstests durchgeführt. Die abgeleiteten P-Werte im Vergleich zur Kontrolle wurden in das Panel eingefügt. f PS band in dosisabhängiger Weise direkt an adhärente junktionale homophile VE-Cadherine (VEC). Nach der Lyse (P) führte die Zugabe von PS in einer Konzentration von 0,05 und 0,5 mg/ml zu einer unbehandelten Kontrolle nicht zu einem Abbau nachweisbarer VE-Cadherine. Protein A/G-Magnetkügelchen (A) wurden hinzugefügt, um zu zeigen, dass ohne die Zugabe von PS keine nachweisbaren VE-Cadherine ausgefällt wurden (n = 3 biologisch unabhängige Experimente). Quelldaten werden als Quelldatendatei bereitgestellt. (Einige Kunstelemente in Panel a stammen von smart.servier.com.)

Neben dem oben beschriebenen carboxylierten PS-Nanoplastik haben wir auch zwei andere Arten von Nanoplastiken eingesetzt, nämlich aminiertes Polystyrol (NH2-PS) und Poly(methylmethacrylat) (PMMA), um die NanoEL-Kompetenz von Nanoplastiken unterschiedlicher Ladung und Chemikalie zu untersuchen Komposition.

In ähnlicher Weise wurden sowohl NH2-PS- als auch PMMA-Nanokunststoffe durch TEM, DLS und XPS charakterisiert. Insbesondere ergab die TEM, dass die durchschnittliche Größe von NH2-PS und PMMA 19,7 ± 3,8 nm bzw. 54,7 ± 6,1 nm betrug (Abb. 3a, ergänzende Abb. 10 und 11), während DLS-Messungen zwei Peaks der hydrodynamischen Größe von anzeigten 31 ± 0,6 nm und 3984 ± 253,4 nm für NH2-PS-Nanoplastik und 89 ± 1,3 nm für PMMA-Nanoplastik in H2O (Ergänzungstabelle 1). Darüber hinaus ergaben ζ-Potentialmessungen eine positive Oberflächenladung von 31,0 ± 1,3 mV für NH2-PS-Nanoplastik und eine negative Oberflächenladung von –24,8 ± 0,7 mV für PMMA (Ergänzungstabelle 1). Die Größe und das ζ-Potenzial von Nanoplastik wurden auch in ECM durch DLS getestet, wobei sich keine signifikanten Veränderungen zeigten. Die Oberflächencharakterisierungen beider Nanoplastiken wurden weiter mit XPS analysiert und zeigten erwartungsgemäß das Vorhandensein von Amidogenen auf dem NH2-PS-Nanoplastik und Carboxylen auf dem PMMA-Nanoplastik (Abb. 3b).

eine TEM-Bildgebung von NH2-PS- und PMMA-Nanoplastiken in H2O (n = 3 unabhängige Proben). b Funktionelle Gruppen von NH2-PS- und PMMA-Nanokunststoffen wurden durch XPS-Analyse bestimmt. Die Hauptpeaks für NH2-PS bei 402,06 und 400,02 eV waren auf die C-N- bzw. N-H-Bindung zurückzuführen. Der dominante Peak für PMMA bei 284,74 eV entstand aus der C-C- oder C=C-Bindung, und die Peaks bei 286,33 eV und 288,57 eV können der C-O- bzw. O=C-OH-Bindung zugeschrieben werden. c, d Zelllebensfähigkeit von NH2-PS- und PMMA-Nanoplastiken bei 0,05 und 0,5 mg/ml, gemessen durch einen CCK8-Assay zu verschiedenen Zeiten (1, 3 und 6 Stunden). Als Positivkontrolle wurde H2O2 (200 μM) verwendet. Die Daten werden als Mittelwert ± SD ausgedrückt (n = 3 biologisch unabhängige Experimente). Die statistische Analyse wurde mittels einer einfaktoriellen ANOVA und anschließenden Tukey-Mehrfachvergleichstests durchgeführt. Die abgeleiteten P-Werte im Vergleich zur Kontrolle wurden in das Panel eingefügt. e, f Der Transwell-Assay zeigte, dass positiv geladenes NH2-PS-Nanoplastik nicht in der Lage war, eine Endothelleckage auszulösen, während negativ geladenes PMMA-Nanoplastik eine Leckage der Endothelzellbarrieren auslöste. Die Daten werden als Mittelwert ± SD ausgedrückt (n = 3 biologisch unabhängige Experimente). Die statistische Analyse wurde mittels Zwei-Wege-ANOVA und anschließenden Tukey-Mehrfachvergleichstests durchgeführt. Die abgeleiteten P-Werte im Vergleich zur Kontrolle wurden in das Panel eingefügt. g Konfokale Fluoreszenzmikroskopie zeigte endotheliale Undichtigkeiten in Gegenwart von PMMA-Nanoplastik (0,05 und 0,5 mg/ml) nach 1-, 3- und 6-stündigen Behandlungen (n = 3 biologisch unabhängige Experimente). Die weißen Pfeile zeigen Lücken zwischen HUVECs an. Während bei der Behandlung mit NH2-PS-Nanoplastik keine Endothelleckage beobachtet wurde. Maßstabsbalken: 20 μm. Quelldaten werden als Quelldatendatei bereitgestellt.

Darüber hinaus haben wir HUVECs beiden Arten von Nanoplastik in unterschiedlichen Konzentrationen und Behandlungsdauern ausgesetzt. Insbesondere hatte eine einstündige Exposition der HUVECs gegenüber NH2-PS-Nanoplastik bei 0,05 mg/ml keinen Einfluss auf die Lebensfähigkeit der Zellen, während die Zellmortalität mit zunehmender Dosierung und Inkubationszeit des Nanoplastiks deutlich zunahm (Abb. 3c). Im Vergleich dazu zeigte der negativ geladene PMMA-Nanokunststoff eine bessere Biokompatibilität und Unschädlichkeit (Abb. 3d). Um außerdem die Störung der VE-Cadherin-Übergänge zu beobachten und den durch Nanoplastik verursachten NanoEL zu quantifizieren, wurde eine Immunfluoreszenzfärbung von VE-Cadherinen eingesetzt und die Permeabilität der endothelialen Monoschicht der HUVECs wurde durch einen Transwell-Assay gemessen (Abb. 3e-g und ergänzende Abb. 12). . Insbesondere zeigte PMMA-Nanoplastik bereits bei der niedrigen Konzentration von 0,05 mg/ml in 1 Stunde die Fähigkeit, NanoEL zu induzieren, was mit zunehmender Nanoplastik-Konzentration und Einwirkzeit stärker ausgeprägt wurde. Es überrascht nicht, dass NH2-PS-Nanoplastik kaum einen Einfluss auf die Endothelleckage hatte. Insgesamt deuten diese Ergebnisse darauf hin, dass NanoEL sowohl bei PS als auch bei PMMA durch negativ geladene Nanoplastiken mit einer Größe von 20–60 nm ausgelöst werden könnte.

Die ROS-Produktion ist ein Kennzeichen der Zytotoxizität22. Viele Metalloxid-Nanopartikel können zelluläre ROS induzieren23, was indirekt zu einer Endothelleckage durch Zytoskelettschäden führt24. Andererseits ist eine zelluläre Aufnahme für das Auftreten der Leckage nicht notwendig21. Unter den relevanten Biomarkern ist 4-Amino-5-(4-methylphenyl)-7-(t-butyl)pyrazolo[3,4-d]-pyrimidin (PP1) ein Src-Kinase-Inhibitor, der die VE-Cadherin-Phosphorylierung hemmt25, rho Der -assoziierte Proteinkinase (ROCK)-Inhibitor Y-27632 verhindert Störungen des Zytoskelettnetzwerks26 und N-Acetyl-L-Cystein (NAC) hemmt die ROS-Erzeugung. Wir fanden heraus, dass die Endozytose-Inhibitoren Methyl-β-Cyclodextrin (MβCD) und Monodansylcadaverin (MDC) die durch das PS-Nanoplastik induzierte Undichtigkeit nicht verhindern konnten, während PP1 und Y-27632 den Prozess abwürgen konnten (Abb. 4a). Wir beobachteten einen signifikanten Anstieg des ROS-Spiegels, nachdem HUVECs 1 Stunde lang mit PS-Nanoplastik behandelt wurden (ergänzende Abbildung 2). Es gab keinen signifikanten Unterschied im Grad der Leckage, wenn die Zellen vor der Nanoplastik-Exposition (0,05 mg/ml) eine Stunde lang mit dem Antioxidans NAC (5 mM) oder den Endozytoseinhibitoren MβCD (5 mM) und MDC (10 µM) behandelt wurden. für 1 Stunde (Abb. 4b). Im Vergleich zur PS-Gruppe waren die Leakiness-Werte in der PP1-Gruppe und der Y-27632-Gruppe jedoch signifikant verringert (P < 0,05 oder P < 0,001). Konsistente Ergebnisse wurden durch die Behandlung von Zellen mit 0,5 mg/ml PS-Nanoplastik erzielt (Abb. 4c). Das obige Phänomen deutete darauf hin, dass die durch PS-Nanoplastik induzierte Endothelleckage unabhängig von der ROS-Bildung und Endozytose war, aber mit dem VE-Cadherin-Signalweg und der Aktin-Remodellierung zusammenhängt.

a Die Blockierung der Endozytose mit Inhibitoren oder ROS-Hemmung konnte das Austreten von PS-Nanoplastik nicht verhindern. Allerdings beeinflussten der Src-Kinase-Inhibitor PP1 und der ROCK-Inhibitor Y-27632 die Undichtigkeit von PS-Nanoplastik. HUVECs wurden mit Src-Kinase-Inhibitor PP1 (10 µM), Rho-assoziierte Proteinkinase (ROCK)-Inhibitor Y-27632 (10 µM), Endozytose-Inhibitoren (5 mM Methyl-β-Cyclodextrin (MβCD) und 10 µM Monodansylcadaverin (MDC) behandelt. ) oder ROS-Inhibitor (5 mM N-Acetyl-L-Cystein (NAC)) für 1 Stunde vor b 0,05 mg/ml oder c 0,5 mg/ml PS-Nanoplastik-Behandlung. PP1 und Y-27632 reduzierten die Penetration von FITC-Dextran im Vergleich zu ihren jeweiligen Gegenstücken ohne Inhibitorbehandlung erheblich. MβCD, MDC oder NAC verringerten die Penetration von FITC-Dextran im Vergleich zu ihren jeweiligen Gegenstücken ohne Inhibitorbehandlungen nicht signifikant. Die Daten werden als Mittelwert ± SD ausgedrückt. Es wurden biologisch unabhängige Proben verwendet (n = 3). Die statistische Analyse wurde mittels einer einfaktoriellen ANOVA und anschließenden Tukey-Mehrfachvergleichstests durchgeführt. Die abgeleiteten P-Werte wurden in das Panel eingefügt. Western-Blot-Analyse von VE-Cadherin und seinen Phosphorylierungsniveaus: d 0,05 mg/ml oder e 0,5 mg/ml Die Behandlung mit PS-Nanoplastik induzierte die Tyrosinphosphorylierung von VE-Cadherin bei Y658 und Y731. PP1 hemmte jedoch wirksam die durch PS-Nanoplastik induzierte Phosphorylierung von VE-Cadherin bei Y658 und Y731. f Die semiquantitative Analyse ergab eine Aktivierung des VE-Cadherin (VEC)-Signals bei Exposition gegenüber PS-Nanoplastik (0,05 oder 0,5 mg/ml). Die Daten werden als Mittelwert ± SD ausgedrückt (n = 3 biologisch unabhängige Experimente). Die statistische Analyse wurde mittels Zwei-Wege-ANOVA und anschließenden Tukey-Mehrfachvergleichstests durchgeführt. Die abgeleiteten P-Werte wurden in das Panel eingefügt. Quelldaten werden als Quelldatendatei bereitgestellt.

Der natürliche Zustand von Endothelzellen in reifen Blutgefäßen ist eine verschmolzene und statische Monoschicht, in der sich VE-Cadherine an den Kontakten zwischen Zellen ansammeln und an den entsprechenden Geweben haften27. VE-Cadherin trägt während der Angiogenese zur Neuordnung des Zytoskeletts28 und zur Neugestaltung von Tight Junctions29 in Endothelzellen bei. Obwohl es andere Funktionen hat, besteht die Hauptfunktion von VE-Cadherin darin, die Adhäsion zwischen Endothelzellen zu fördern und die Zellpermeabilität zu erhöhen, wenn Verbindungen unterbrochen sind27. Die Tyrosinkinase Src aktiviert die Phosphorylierung von VE-Cadherin an den Resten Y658 und Y73130. VE-Cadherin interagiert über seinen zytoplasmatischen Schwanz mit p120 und β-Catenin, um die Zelladhäsion zu fördern31. Die Tyrosinphosphorylierung des zytoplasmatischen Schwanzes von VE-Cadherin stört die p120-Bindung und destabilisiert die Wechselwirkung zwischen VE-Cadherin und zytoplasmatischem Catenin, wodurch durch die seitliche Verschiebung von phosphoryliertem VE-Cadherin Lücken entstehen32. Wir verwendeten PP1, um festzustellen, ob das PS-Nanoplastik die Src-Kinase aktivierte, um die VE-Cadherin-Phosphorylierung zu induzieren. Bei HUVECs, die mit PS-Nanoplastik von 0,05 oder 0,5 mg/ml behandelt wurden, verhinderte PP1 die VE-Cadherin-Phosphorylierung an den Y658- und Y731-Resten (Abb. 4d, e). Es kam zu einer signifikanten Abnahme der Phosphorylierungsniveaus der Y658- und Y731-Reste von VE-Cadherin, wenn die Zellen vor der Einführung von PS-Nanoplastik (0,05 oder 0,5 mg/ml) über verschiedene Zeiträume eine Stunde lang mit PP1 (10 µM) behandelt wurden (1). , 3 oder 6 h) (Abb. 4f). Unsere Daten zeigten außerdem, dass PS-Nanoplastik die Phosphorylierung von VE-Cadherin auslösen kann, was die interzellulären Lücken vergrößern und Undichtigkeiten hervorrufen kann. Darüber hinaus fanden wir heraus, dass PMMA (0,05 oder 0,5 mg/ml) auch die Phosphorylierung von VE-Cadherinen induzierte (ergänzende Abbildung 13).

Um die durch PS-Nanoplastik induzierte VE-Cadherin-Dimer-Störung zu charakterisieren, führten wir Simulationen der diskreten Molekulardynamik (DMD) aller Atome mit impliziten Lösungsmittelmodellen durch. Bevor eine In-silico-Zugkraft ausgeübt wurde, wurde zunächst eine Bindungssimulation eines Cadherindimers mit PS-Nanoplastik durchgeführt. Wir verwendeten das erste extrazelluläre Domänendimer (EC1) von VE-Cadherin voller Länge, da die domänengetauschte Region im EC1-Dimer für die Trans-Zell-zu-Zell-Adhäsion wichtig ist21 (Abb. 5a). Als nächstes wurde PS-Nanoplastik mit Carboxyl-Oberflächengruppen konstruiert, um ihre Kompetenz mit NanoEL zu untersuchen. Aufgrund des hohen Rechenaufwands im Zusammenhang mit der großen Größe von PS haben wir PS-Nanoplastik modelliert, das aus 20 sich wiederholenden PS-Ketten besteht, und der Durchmesser des gebildeten Nanoplastiks entsprach ∼15 Å für die 50-ns-Gleichgewichts-DMD-Simulation (Abb. 5b). Sowohl rechnerisch als auch experimentell wurde gezeigt, dass ungeladene PS-Ketten ähnlicher Größe direkt mit Zellen interagieren und Plasmamembranen durchdringen33,34. Hier wurde wie in den Experimenten negativ geladenes PS modelliert, das mit Carboxylgruppen modifiziert war, um ihre direkten Wechselwirkungen mit Zellmembranen, die negativ geladene Lipide enthalten, zu minimieren. Anschließend wurde das konstruierte Nanoplastik zufällig aus dem EC1-Dimer lokalisiert und 30 unabhängige Bindungssimulationen durchgeführt, um die Bindungsstellen des PS-Nanoplastiks mit dem EC1-Cadherin-Dimer zu identifizieren. Die berechnete Bindungsfrequenz zeigte, dass PS-Nanoplastik nach 50 ns stark an die Reste 32–38, 42, 46–51 und 76–81 im VE-Cadherin-Dimer gebunden war (ergänzende Abbildung 14a). Diese Regionen befanden sich abseits der Grenzflächenregion des Dimers und waren reich an positiv geladenen Resten, wie aus der Oberflächendarstellung des Dimers hervorgeht, die entsprechend den Nanoplastik-Bindungsfrequenzen farbcodiert war (Abb. 5c). Die Daten zur Bindungshäufigkeit deuten darauf hin, dass das PS-Nanoplastik bevorzugt in der Nähe der Krümmungsregion des Dimers bindet. Unmodifizierte PS-Kette hingegen ist aufgrund hydrophober Wechselwirkungen an die Dimerschnittstelle (Reste 1–4, 85–89) gebunden (ergänzende Abbildung 15a, b). Daher führten die elektrostatischen Wechselwirkungen zwischen den Carboxylgruppen auf der Oberfläche des PS-Nanoplastiks und den positiv geladenen Resten im Krümmungsbereich des Dimers zur Assoziation der beiden Einheiten.

a Struktur des EC1-Cadherin-Dimers. Rote Stäbchen und graue Kugeln zeigen den domänengetauschten Bereich bzw. die Calciumionen an. b Struktur eines carboxylierten PS-Nanoplastiks nach 50 ns Gleichgewichts-DMD-Simulation. c Farbcodierte Bindungsfrequenz des PS-Nanoplastiks auf der EC1-Cadherin-Dimer-Oberfläche. Blaue und rote Farben stehen für niedrige bis hohe Bindungsfrequenzen. Das vergrößerte Panel zeigt die Bindung von Nanoplastik mit dem EC1-Dimer. d Violindiagramme der Dimerbindung mit dem PS-Nanoplastik. e Repräsentative Dissoziationstrajektorien des Dimers in Gegenwart des PS-Nanoplastiks unter 0 pN Zugkraft.

Zusätzlich zur Bindungssimulation führten wir außerdem eine gelenkte DMD-Simulation (sDMD) durch, um die Auswirkungen von PS-Nanoplastik auf die Stabilität des Cadherin-Dimers sowie die Cadherin-Dissoziation zu bestimmen. Hier betrachteten wir einen niedrigen Kraftbereich (0–20 pN), der ausreichte, um das EC1-Dimer durch Goldnanopartikel aufzubrechen21, um die Stabilität des Cadherin-Dimers zu messen. Wir immobilisierten eine der EC1-Domänen und übten eine konstante Kraft auf die andere EC1-Domäne aus, wobei die Richtung zur zugehörigen EC2-Domäne zeigte (ergänzende Abbildung 14b). Für jeden Fall der angewendeten Kräfte wurden 30 unabhängige sDMD-Simulationen mit anfänglich randomisierten Geschwindigkeiten für 100 ns durchgeführt. Für die sDMD-Simulationen haben wir die erste mittlere Dissoziationszeit des Cadherindimers berechnet, als die Anzahl der Atomkontakte zwischen dem Cadherindimer auf Null reduziert wurde. Als Funktion der Dissoziationszeit und der angelegten konstanten Kräfte wurde ein Geigendiagramm erstellt (Abb. 5d). Wir fanden heraus, dass das PS-Nanoplastik im Vergleich zur Kontrolle von Cadherinen ohne PS-Nanoplastik eine hohe Wahrscheinlichkeit einer frühen Dissoziation des EC1-Dimers induzierte. Es wurde eine hohe Wahrscheinlichkeit für kurze Dissoziationszeiten beobachtet, wenn die Größe der angewendeten Kräfte erhöht wurde. Repräsentative Flugbahnen zeigten, dass gebundenes Nanoplastik eine frühe Dissoziation des Cadherindimers verursachte (Abb. 5e). Im Gegensatz dazu destabilisierte die Bindung der unmodifizierten PS-Kette an die Dimerschnittstelle das Dimer nicht (ergänzende Abbildung 15c). Um die durch PS-Nanoplastik induzierte verringerte Stabilität des Cadherindimers zu bestätigen, haben wir die Verteilung des Dimerwinkels und der quadratischen Mittelfluktuation (RMSF) der flexiblen Domänen des Dimers für die ersten 30 ns der Simulation ohne angelegte Kräfte weiter berechnet (Ergänzung). Abb. 14c, e). Wir haben zuvor herausgefunden, dass anorganische Goldnanopartikel das EC1-Dimer von stabilen (s-Dimer) in Zwischenzustände (x-Dimer) verschieben und gleichzeitig die Entropie des Cadherin-Dimers reduzieren, um seine inhärente Funktion zu stören21. In der vorliegenden Arbeit legen unsere Berechnungsergebnisse nahe, dass die Bindung von PS-Nanoplastik das Cadherindimer über einen ähnlichen molekularen Mechanismus destabilisiert, indem der Dimerzustand vom S-Dimer zum X-Dimer geändert und die Flexibilität des Dimers verringert wird.

Zusätzlich zu PS untersuchten wir auch, wie PMMA-Nanoplastik eine Störung des Cadherindimers hervorrufen könnte. Es wurde festgestellt, dass das negativ geladene 20-mer-PMMA, das durch Entfernen von Methylgruppen einer Teilmenge zusammengesetzter Wiederholungen modifiziert wurde, nach 50-ns-DMD-Gleichgewichtssimulationen eine kompakte Kügelchen bildete (ergänzende Abbildung 16a). Wir haben die Bindungshäufigkeit von PMMA mit dem Cadherindimer über 50-ns-Bindungs-DMD-Simulationen berechnet. PMMA-Nanoplastik hatte eine ähnlich starke Bindung an die gleichen Windungsregionen in Cadherin wie PS-Nanoplastik (Abb. 5a), aber auch eine schwache Bindung an die Grenzflächenregionen des Dimers (ergänzende Abb. 16b, c). Nachfolgende sDMD-Simulationen des Cadherindimers mit PMMA-Nanoplastik zeigten, dass PMMA-Nanoplastik auch die Dissoziation des Cadherindimers bei geringen Kräften erhöhte (ergänzende Abbildung 16d). Interessanterweise wurde aufgrund der zusätzlichen Bindung von PMMA an die Cadherin-Dimer-Schnittstelle ein alternativer Dissoziationsweg mit konkurrierender Bindung des Nanoplastiks an eines der Cadherin-Monomere beobachtet (ergänzende Abbildung 16e). Unabhängig von ihrer chemischen Zusammensetzung lösten sowohl anionische PS- als auch PMMA-Nanoplastiken eine Dissoziation des Cadherindimers aus. Obwohl die Größen der PS- und PMMA-Nanoplastiken aufgrund der Notwendigkeit, die Rechenkosten zu reduzieren, nicht direkt mit denen in den Experimenten vergleichbar waren, zeigten unsere zusätzlichen Simulationen, dass eine Reihe von PS-Nanoplastiken mit einer Vergrößerung von bis zu 80 mer das Cadherin durchweg zerstörten Dimer (Abb. 5e und ergänzende Abb. 17). Daher wird erwartet, dass sich große Nanoplastiken bei der Interaktion mit dem VE-Cadherin-Dimer ähnlich verhalten. Insgesamt bestätigten unsere In-silico-Daten die experimentellen Beobachtungen, dass PS- und PMMA-Nanoplastiken in der Lage waren, die Cadherin-Cadherin-Assoziation zu stören, und unsere Simulationen zeigten außerdem, dass die Bindung von Nanoplastiken die Stabilität des Cadherin-Dimers durch eine erhöhte Spannung zwischen den Domänen und eine verringerte Entropie verringerte.

Zusätzlich zu den In-vitro- und In-silico-Untersuchungen führten wir auch Ex-vivo-Tests mit Kaninchen- und Schweinegefäßen durch, um die durch PS-Nanoplastik induzierte Leckage in diesen Gefäßendothelien zu messen (Abb. 6a). Es wurde beobachtet, dass die Fluoreszenzintensität von ausgetretenem EBD in Kaninchengefäßen mit der erhöhten Konzentration an PS-Nanoplastik zunahm (Abb. 6b). Ein ähnliches Phänomen beobachteten wir bei Schweinegefäßen (Abb. 6c). Wenn Schweinegefäße 6 Stunden lang mit 0,5 und 5 mg/ml PS-Nanoplastik behandelt wurden, war die Undichtigkeit der Schweinegefäße im Vergleich zur Kontrolle deutlich erhöht (P < 0,001). Gleichzeitig konnten wir ex vivo auch eine Phosphorylierung von VE-Cadherinen nachweisen (ergänzende Abbildung 18).

a Schematische Darstellung des Ex-vivo-Konstrukts. b Konzentrationsabhängiger Anstieg der Penetration des Evans-Blau-Farbstoffs (EBD) in Kaninchengefäßen. Quantifizierungen von EBD zeigten, dass sich die Nanoplastikgruppen aus Polystyrol (PS) mit 0,05 und 0,5 mg/ml deutlich von der unbehandelten Kontrolle unterschieden. 0,5 mg/ml PS-Nanoplastik verursachte mehr Leckage als die 0,05 mg/ml PS-Nanoplastik-Gruppe. Die Daten werden als Mittelwert ± SD ausgedrückt. Es wurden biologisch unabhängige Proben verwendet (n = 3). Die statistische Analyse wurde mittels einer einfaktoriellen ANOVA und anschließenden Tukey-Mehrfachvergleichstests durchgeführt. Die abgeleiteten P-Werte im Vergleich zur Kontrolle wurden in das Panel eingefügt. c Konzentrationsabhängiger Anstieg der EBD-Penetration in Schweinegefäßen. Die EBD-Penetration war in der Gruppe mit 5 mg/ml PS-Nanoplastik ausgeprägter als in der Gruppe mit 0,5 mg/ml PS-Nanoplastik. Die Daten werden als Mittelwert ± SD (n = 3 biologisch unabhängige Proben) dargestellt und über eine einfache ANOVA analysiert, gefolgt von Tukeys Mehrfachvergleichstests. Die abgeleiteten P-Werte im Vergleich zur Kontrolle wurden in das Panel eingefügt. d Männliche Swiss-Mäuse erhielten eine intravenöse Injektion einer PS-Nanoplastik (1,5, 15 oder 30 mg/kg) enthaltenden 10 mM EBD-Lösung. Kontrollmäuse erhielten einmalig eine intravenöse Injektion von 10 mM EBD. Nach 24 Stunden wurden die Mäuse getötet, um ihre Organe für die Bildgebung zu sammeln. Das Fluoreszenzsignal stieg mit zunehmender Dosis des Nanoplastiks allmählich von gelb nach rot an. Je größer die EBD-Leckage war, desto stärker war das Fluoreszenzsignal. Das PS-Nanoplastik förderte die Undichtigkeit subkutaner Blutgefäße bei Mäusen. PS-Nanoplastik (30 mg/kg) wurde in subkutane Taschen auf dem Rücken der Mäuse injiziert. EBD wurde über eine intravenöse Schwanzinjektion injiziert. Die Quantifizierung von EBD zeigte eine stärkere Endothelleckage in der PS-Gruppe im Vergleich zur unbehandelten Mäusegruppe. Die Daten werden als Mittelwert ± SD (n = 3 biologisch unabhängige Tiere) ausgedrückt und mithilfe des zweiseitigen Student-T-Tests analysiert. Die abgeleiteten P-Werte im Vergleich zur Kontrolle wurden in das Panel eingefügt. Quelldaten werden als Quelldatendatei bereitgestellt. (Einige Kunstelemente in Panel a stammen von smart.servier.com.)

Wir haben die durch PS-Nanoplastik induzierte Endothelleckage in vivo weiter untersucht. Bei Studien zur intravenösen Verabreichung von Nanopartikeln reichern sich die Nanopartikel hauptsächlich in Leber und Milz usw. an35,36. In unserem Experiment wurde Mäusen eine intravenöse Injektion einer EBD-Lösung mit PS-Nanoplastik unterzogen. Nach 24 Stunden beobachteten wir, dass bei PS-Nanoplastik in Dosen von 1,5 mg/kg, 15 mg/kg und 30 mg/kg die Leckage von EBD hauptsächlich im Gehirn, der Leber, der Milz und der Lunge der Mäuse auftrat ( Abb. 6d). Es gab auch eine geringe Fluoreszenz von ausgetretenem EBD in den Nieren und im Zwerchfell. Wir haben die Fluoreszenzintensitäten von ausgetretenem EBD in Geweben quantitativ analysiert. Mit Ausnahme des Herzens stiegen die Fluoreszenzintensitäten von ausgetretenem EBD in Gehirn, Leber, Milz, Lunge, Nieren und Zwerchfell mit der Einführung des PS-Nanoplastiks deutlich an (ergänzende Abbildung 19). Endothelzellen bilden eine physikalische Barriere zwischen dem Kreislauf und dem darunter liegenden Gewebe. Bestimmte Reize können jedoch zu einer teilweisen Störung der Endothelbarriere führen und dadurch die Flüssigkeitsextravasation aus dem Kreislauf in das Interstitium oberhalb des Basalspiegels erhöhen37. Eine langfristige Erhöhung der Permeabilität kann zur Zerstörung von Zell-Zell-Verbindungen führen, was wiederum zu einer veränderten Gefäßintegrität führt27. Um zu untersuchen, ob PS-Nanoplastik zu Undichtigkeiten in subkutanen Blutgefäßen führen kann, injizierten wir EBD in die Schwanzvenen von Mäusen, gefolgt von entweder Vehikelkontroll-PBS-Puffer oder PS-Nanoplastik, das in die subkutanen Taschen injiziert wurde. Basierend auf Quantifizierungen verursachte PS-Nanoplastik eine EBD-Extravasation im subkutanen Gefäßsystem und bestätigte damit das Auftreten einer Endothelleckage (Abb. 6e).

Das Verständnis der Umweltbelastung, einschließlich des Lebenszyklus und des CO2-Fußabdrucks fossiler Kunststoffe, ist eine große Herausforderung, vor der die Welt heute steht. Diese Herausforderung ergibt sich aus der immer stärkeren Verbreitung von Kunststoffen in industriellem Maßstab und ihrem bemerkenswert langsamen Abbau in der natürlichen Umwelt. Tatsächlich sind die möglichen schädlichen Auswirkungen von Kunststoffen auf die menschliche Gesundheit, sei es durch direkte Exposition oder durch trophische Übertragung in die Ökosphäre, weiterhin unklar. Dies gilt insbesondere für Nanoplastik, eine denkbare Endform von Kunststoffen durch die Kräfte von Mensch und Natur, deren biologische Auswirkungen erst in den letzten Jahren sichtbar werden. In dieser Studie haben wir unsere Entdeckung der durch anionisches Polystyrol und PMMA-Nanoplastik induzierten Endothelleckage dokumentiert, die durch Techniken der konfokalen Fluoreszenzbildgebung, Transwell-Assays, Signalwege mit HUVCEs, Kaninchen- und Schweinegefäßen und Mäusen sowie virtuelle Kraftmikroskopie charakterisiert wurde von Computersimulationen. Die Endothelleckage zeigte eine Dosis- und Zeitabhängigkeit von der Zellexposition gegenüber beiden Arten von Nanoplastik, vermittelt durch Konformations- und Strukturänderungen an VE-Cadherin-Übergängen von Endothelzellen, die mit den Polymernanopartikeln in Kontakt stehen, und unabhängig von der ROS-Produktion, Autophagie und Apoptose der betroffenen Zellen . Da das Auftreten endothelialer Undichtigkeiten darauf hindeutet, dass Nanoplastik in das Gefäßsystem, das den Körper ausbreitet, hinein und aus diesem heraus eindringen könnte, bedeutet diese Entdeckung weitreichende Auswirkungen auf das Verständnis der Sicherheit und des biologischen Fußabdrucks synthetischer Kunststoffmaterialien, die sich in der Umwelt tummeln.

Alle Tierversuche entsprachen den ethischen Vorschriften für Tierversuche und Forschung gemäß den Richtlinien des NIH und wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) der Southwest University genehmigt (Referenz (ID-Nummer) IACUC-20200525-01).

Für die TEM-Bildgebung von PS (30 nm carboxylierte PS-Perlen, Katalognummer L5155, Sigma-Aldrich, USA), NH2-PS (30 nm aminierte PS-Perlen, Katalognummer: PSGF00030, Zhongke Detong Inc, China) und PMMA (50 nm). carboxyliertes PMMA, Katalognummer: BKPMMA50, Beikenami Inc, China) Nanoplastik, 5 µL der Proben wurden auf glimmentladene, mit Formvar/Kohlenstoff beschichtete Kupfergitter (400 Mesh, ProSciTech) getropft. Nach einer Minute Inkubation wurden die Gitter getrocknet und mit 10 μL Milli-Q H2O gewaschen und dann mit 5 μL Uranylacetat (UA, 1 %) negativ gefärbt. Die Proben wurden mit einem FEI Tecnai F20 abgebildet, der bei 200 kV betrieben wurde. Die Größenverteilung wurde mit der Software ImageJ 1.53c analysiert. Die hydrodynamischen Durchmesser der PS-, NH2-PS- und PMMA-Nanokunststoffe wurden durch dynamische Lichtstreuung (DLS) mit Zetasizer Nano-ZS (Malvern) bei Raumtemperatur bestimmt. Die Oberflächenelementzusammensetzungen und der chemische Zustand der Nanoplastiken wurden mittels Röntgenphotoelektronenspektroskopie (XPS, Thermo escalab 250X, USA) identifiziert. Die PS-, NH2-PS- und PMMA-Nanokunststoffe wurden mit einem Gefriertrockner (Alpha2-42DPlus, Christ) gefriergetrocknet. Anschließend wurde die Pulverprobe mit leitfähigem Klebstoff auf den Probentisch geklebt und anschließend nach dem Vakuumieren getestet.

Menschliche Endothelzellen aus der Nabelschnurvene (HUVECs, CRL-1730) wurden von der American Type Culture Collection (ATCC, USA) erhalten und in vollständigem Endothelzellmedium (ECM, ScienCell, USA) kultiviert, das 10 % fötales Rinderserum (FBS, Gibco, USA). Die Zellen wurden bei 37 °C in einer feuchten Atmosphäre mit 5 % CO2 in der Luft inkubiert. Als die Zellen Konfluenz erreichten, wurde 0,25 % Trypsin verwendet, um die Zellen 4 Minuten lang zu verdauen. Dann wurde Trypsin entfernt und serumhaltiges Medium zu der Mischung gegeben, um die Verdauung zu stoppen. Die Zellen wurden abpipettiert, zentrifugiert und in einem neuen Medium resuspendiert.

Ungefähr 1 × 106 Zellen/Well wurden über Nacht in 6-Well-Platten ausgesät, gefolgt von der Behandlung mit PS-Nanoplastik oder NH2-PS-Nanoplastik bei 0,05 oder 0,5 mg/ml für 1, 3 oder 6 Stunden. Anschließend wurden die Zellen mit PBS gewaschen und mithilfe einer BD FACS MelodyTM-Durchflusszytometrie analysiert. Für jede Probe wurden aus drei unabhängigen Experimenten insgesamt 1 × 104 Ereignisse erfasst. Die Daten wurden von FlowJo_V10 analysiert.

Ungefähr 1 × 106 Zellen/Well wurden auf 6-Well-Platten gezüchtet und 1, 3 oder 6 Stunden lang dem PS-Nanoplastik (0,05, 0,1, 0,25 und 0,5 mg/ml) ausgesetzt. Zellen in der Kontrollgruppe erhielten 1, 3 oder 6 Stunden lang eine Behandlung mit serumfreiem Medium und wurden dann 30 Minuten lang mit dem DCFH-DA-Indikator (Sigma-Aldrich, USA) im Dunkeln bei 37 °C inkubiert. Die Zellen wurden zweimal mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) gewaschen. Die Zellfluoreszenz wurde mit einem BD FACS MelodyTM-Durchflusszytometer analysiert. Die Experimente wurden dreimal unabhängig voneinander wiederholt. Die Daten wurden von FlowJo_V10 analysiert.

HUVECs (5 × 104 Zellen/Well) wurden in eine schwarze 96-Well-Platte mit klarem Boden (Corning Costar, USA) ausgesät und 48 Stunden lang bei 37 ° C kultiviert. Die alten Medien wurden durch frisches ECM mit 1 × 10–6 M Propidiumiodid (PI, Sigma-Aldrich, USA) ersetzt. Nach 30-minütiger Inkubation wurden die Zellen unterschiedlichen Konzentrationen von PS-Nanoplastik ausgesetzt (0, 0,05, 0,1, 0,25 und 0,5 mg/ml). Anschließend wurden die Zellmorphologie und die Anzahl toter Zellen unter Verwendung von Operetta (20× PlanApo-Objektiv, numerische Apertur NA = 0,7, PerkinElmer) mit einer Lebendzellkammer (37 °C, 5 % CO2) über 22 Stunden gemessen. Die Zellmortalität wurde von PI-positiven Zellen zu Gesamtzellzahlen berechnet, die aus der Hellfeld-Mapping-Funktion der Harmony High-Content Imaging and Analysis-Software (PerkinElmer) abgeleitet wurden. HUVECs (5 × 103 Zellen/Well) wurden über Nacht in einer 96-Well-Platte ausgesät, bevor sie 1 Stunde, 3 Stunden und 6 Stunden lang mit PS-, NH2-PS- und PMMA-Nanoplastik (0,05 und 0,5 mg/ml) behandelt wurden. Die Negativkontrolle wurde 1, 3 oder 6 Stunden lang frischem Medium ausgesetzt. Die Positivkontrolle wurde 1, 3 oder 6 Stunden lang 200 μM H2O2 ausgesetzt. Anschließend wurde in jede Vertiefung ein Volumen von 100 μl Medium und 10 μl CCK8-Reagenz gegeben und 2 Stunden lang bei 37 °C inkubiert. Die Absorption jeder Kulturvertiefung wurde mit einem Mikroplattenlesegerät (BioTek, USA) bei einer Wellenlänge von 450 nm gemessen.

HUVECs in einer Konzentration von 1 × 106 Zellen/Well wurden in 6-Well-Platten (Dingjin, China) ausgesät. Für den Autophagie-Signalweg wurden die Zellen für verschiedene Zeiten (1, 3 oder 6 Stunden) mit PS-Nanoplastik (0,05 oder 0,5 mg/ml) behandelt, die Negativkontrolle wurde 1, 3 oder 6 Stunden lang frischem Medium ausgesetzt. Für eine 6-stündige Behandlung mit PS-Nanoplastik (0,05 oder 0,5 mg/ml) wurde die Negativkontrolle 6 Stunden lang frischem Medium ausgesetzt. Für den Apoptose-Signalweg-Assay wurden die Zellen 6 Stunden lang mit PS-Nanoplastik (0,05 oder 0,5 mg/ml) behandelt und die Negativkontrolle wurde 6 Stunden lang frischem Medium ausgesetzt. Für den VE-Cadherin-Signalwegtest wurden die Zellen 1 Stunde lang mit dem Src-Kinase-Inhibitor PP1 (10 µM) behandelt, bevor sie 1, 3 oder 6 Stunden lang mit PS-Nanoplastik (0,05 oder 0,5 mg/ml) behandelt wurden. Gruppen ohne PP1 wurden 1, 3 oder 6 Stunden lang frischem Medium ausgesetzt, das nur mit PS-Nanoplastik (0,05 oder 0,5 mg/ml) behandelt wurde. Die Negativkontrolle wurde frischem Medium ausgesetzt. Für den VE-Cadherin-Signalwegtest wurden die Zellen 1, 3 oder 6 Stunden lang mit PMMA-Nanoplastik (0,05 oder 0,5 mg/ml) behandelt. Nach dreimaligem Waschen mit PBS wurden die Zellen 10 Minuten lang mit Lysepuffer auf Eis lysiert. Für den VE-Cadherin-Signalwegtest in Ex-vivo-Modellen wurden Kaninchen- und Schweinegefäße bei 4 °C homogenisiert und 20 Minuten lang bei 10.000 g und 4 °C zentrifugiert, und die Überstände wurden gesammelt. Die Proteinkonzentrationen von Zelllysaten wurden mit der Carmassi-Bradford-Methode bestimmt. Zellproteine ​​aus jeder Gruppe wurden durch standardmäßige 8 % oder 12,5 % oder 15 % Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) aufgetrennt und dann auf Nitrozellulosemembranen (PALL, USA) geblottet. Die Membranen wurden 2 Stunden lang bei Raumtemperatur mit 5 % Magermilch blockiert und dann 3 Stunden lang mit einem entsprechenden Primärantikörper bei Raumtemperatur inkubiert. Die Membranen wurden mit Tween 20 (Biofroxx, Deutschland)/Tris-gepufferter Kochsalzlösung (TBST) gewaschen und mit biotinyliertem Ziegen-Anti-Kaninchen-IgG (H + L) oder biotinyliertem Ziegen-Anti-Maus-IgG (H + L)-Antikörper (1: 2000-Verdünnung, Sangon, China) für 1 Stunde und mit HRP-markiertem Streptavidin-Antikörper (1:5000-Verdünnung, Sangon, China) für 1 Stunde bei Raumtemperatur. Die Membranen wurden im System der elektrogenerierten Chemilumineszenz (ECL) sichtbar gemacht. Repräsentative Bilder wurden aus mindestens drei unabhängigen Experimenten ausgewählt. Die Bilder der Proteinbanden wurden semiquantitativ mit der Software ImageJ 1.53c analysiert. Die unbeschnittenen Scans der Blots wurden in der Quelldatendatei bereitgestellt. Die primären und sekundären Antikörper sind in der Ergänzungstabelle 2 aufgeführt.

HUVECs in einer Konzentration von 1 × 106 Zellen/Well wurden in 6-Well-Platten (Dingjin, China) ausgesät. Die Zellen wurden 6 Stunden lang mit PS-Nanoplastik (0,05 oder 0,5 mg/ml) behandelt. Anschließend wurden die Zellen lysiert und zur RNA-Extraktion mit einem Gesamt-RNA-Reinigungskit (BioTeke, China) gesammelt. Die gereinigte RNA wurde mit dem Transkriptor-Erststrang-cDNA-Synthesekit (Yeasen, China) revers in cDNA transkribiert. Als nächstes wurde die cDNA durch RT-qPCR-Analyse unter Verwendung von 2× SYBR Green qPCR Master Mix (Bimake, USA) in einem Echtzeit-PCR-Gerät (Roche, Schweiz) analysiert. Daten aus drei unabhängigen Experimenten wurden mit β-Actin als internem Standard analysiert. Die für die Amplifikation verwendeten Primer sind in der Ergänzungstabelle 3 aufgeführt.

HUVECs wurden in konfokalen Schalen mit einer Dichte von 8 × 104 Zellen/Vertiefung ausgesät und 24 Stunden lang kultiviert. Die Zellen wurden 6 Stunden lang mit PS-Nanoplastik (0,05 oder 0,5 mg/ml) behandelt. Anschließend wurden die Zellen 10 Minuten lang mit DAPI (200 μl) gefärbt. Nach dreimaligem Waschen mit PBS wurden die morphologischen Merkmale der Zellen mit einem konfokalen Fluoreszenzmikroskop (Nikon, N-SIM E) erfasst.

HUVECs (5 × 105 Zellen/Well) wurden auf Kammerobjektträgern mit 8 Wells ausgesät und 5–6 Tage lang kultiviert, um eine intakte Monoschicht zu bilden. Dann wurden PS-Nanoplastik, NH2-PS und PMMA in Mengen von 0,05 und 0,5 mg/ml in frischem Zellmedium in die Vertiefungen gegeben und mit den Zellen 1, 3 oder 6 Stunden lang inkubiert. Danach wurden die Zellen zweimal sorgfältig mit Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS, Sigma Aldrich, USA) gewaschen und weiter mit 4 % Paraformaldehyd (PFA, Sigma Aldrich, USA) für 15 Minuten bei Raumtemperatur fixiert. Nach dem Waschen mit PBS wurden die Zellen mit 0,1 % Saponin und 5 % Pferdeserum in PBS für 1 Stunde bei Raumtemperatur blockiert. Anschließend wurde eine Immunfärbung durchgeführt, um die Expression von VE-Cadherinen und Aktinfilamenten hervorzurufen. Polyklonaler Kaninchen-Anti-VE-Cadherin-Antikörper im Verhältnis 1:400 in 5 % Pferdeserum/PBS wurde in die Kammervertiefungen gegeben und über Nacht bei 4 °C inkubiert. Nach dem Waschen mit PBS wurden die Zellen mit sekundärer Antikörperlösung (Donkey Anti-Kaninchen Alexa Fluor 594 im Verhältnis 1:500 in PBS mit 0,1 % Phalloidin-iFluor 488) 2 Stunden lang bei Raumtemperatur inkubiert. Dann wurde Hoechst 33342 (Thermo Fisher Scientific, USA) im Verhältnis 1:2.000 in PBS zu den Zellen gegeben und 5 Minuten lang inkubiert. Die Kammerobjektträger wurden dann mit einem konfokalen Fluoreszenzmikroskop (SP8 LIGHTNING, Leica Microsystems) mit 63-fachem Ölobjektiv abgebildet. Die semiquantitative Bildanalyse für Lückenfläche und Aktinintensität wurde mit der Software ImageJ 1.53c durchgeführt.

HUVECs wurden in Transwell-Einsätze (Polycarbonatmembran, 0,4 μm Porendurchmesser; Corning Costar, USA) mit etwa 8 × 10 Zellen ausgesät und 4 Tage lang gezüchtet, um eine Konfluenz von etwa 100 % zu erreichen und eine intakte Monoschicht zu bilden. Anschließend wurden die Zellen 1, 3 oder 6 Stunden lang mit PS (0,05, 0,1, 0,25 und 0,5 mg/ml), NH2-PS (0,05 und 0,5 mg/ml) oder PMMA (0,05 und 0,5 mg/ml) Nanoplastik behandelt. Für den pharmazeutischen Hemmungstest wurden die Zellen mit entsprechenden Inhibitoren, Endozytose-Inhibitor 5 mM Methyl-β-Cyclodextrin (MβCD, Solarbio, China) oder 10 μM Monodansylcadaverin (MDC, Sigma Aldrich, USA), 10 μM ROCK-Inhibitor Y-27632 (Yuanye) behandelt , China), 10 µM Src-Kinase-Inhibitor PP1 (Yuanye, China) oder 5 mM ROS-Inhibitor N-Acetyl-L-Cystein (NAC, Sigma Aldrich, USA) für 1 Stunde vor PS-Nanoplastik (0,05 oder 0,5 mg/ml) Behandlung für 1 Stunde. Gruppen ohne Inhibitoren wurden 1 Stunde lang frischem Medium mit nur PS-Nanoplastik ausgesetzt. Die Negativkontrolle wurde 1 Stunde lang frischem Medium ausgesetzt. Nach der Behandlung wurden die Zellen zweimal sorgfältig mit PBS gewaschen. 100 μl FITC-Dextran (durchschnittliches Molekulargewicht 40.000, Sigma-Aldrich, USA) mit einer Endkonzentration von 1 mg/ml wurden in jede Vertiefung gegeben und die Medien aus dem unteren Fach wurden nach 30 Minuten gesammelt. Die Fluoreszenzintensitäten wurden bei Anregung/Emission von 495 nm/519 nm mit einem Mikroplatten-Lesegerät gemessen. Die Messwerte der Negativkontrollgruppe wurden verwendet, um die Messwerte der anderen Gruppen zu normalisieren.

HUVECs wurden in einer 96-Well-Platte (schwarzer/klarer Boden, Corning Costar, USA) mit etwa 5 × 104 Zellen/Well ausgesät und 48 Stunden lang bei 37 °C inkubiert. Anschließend wurden die Zellen für verschiedene Zeiträume (1, 3 und 6 Stunden) mit PS-Nanoplastik (0,05, 0,1, 0,25 und 0,5 mg/ml) behandelt. Zellen in der Kontrollgruppe erhielten unterschiedlich lange (1, 3 und 6 Stunden) eine Behandlung mit serumfreiem Medium. Die intrazelluläre Fluoreszenz wurde mit Operetta (PerkinElmer, 20× PlanApo-Mikroskopobjektiv, numerische Apertur NA = 0,7) gemessen.

Konfluente Monoschichten von HUVECs wurden für verschiedene Zeiträume (1, 3 und 6 Stunden) mit PS-Nanoplastik (0,05 und 0,5 mg/ml) behandelt. Anschließend wurden die Proteine ​​mit Lysepuffer extrahiert. PS-Nanoplastik mit den dazugehörigen Proteinen wurde durch Zentrifugation (10.000 g, 20 Min., 4 °C) zerkleinert. PS-Nanoplastik wurde dreimal mit RIPA-Puffer gewaschen und die assoziierten Proteine ​​wurden 10 Minuten lang bei 97 °C in Ladepuffer vom PS-Nanoplastik denaturiert. Für das Pulldown-Experiment nach der Lyse wurden HUVECs lysiert und mit PS-Nanoplastik (0,05 und 0,5 mg/ml) oder Protein A/G-Magnetkügelchen (Bimake, USA) versetzt. Anschließend wurden die Mischungen 1 Stunde lang bei 4 °C leicht geschüttelt. Anschließend wurden PS-Nanoplastik- oder Protein-A/G-Magnetkügelchen mit den zugehörigen Proteinen durch Zentrifugation (10.000 g, 20 Min., 4 °C) abgezogen und dreimal mit RIPA-Puffer gewaschen. Die Proteine ​​wurden durch standardmäßige 8 % SDS-PAGE aufgetrennt und dann auf Polyvinylidenfluorid (PVDF)-Membranen übertragen. Anschließend wurden die Membranen mit Antikörpern gegen VE-Cadherin (1:1000; Abcam, USA) und α-Tubulin (1:2000; Proteintech, China) untersucht.

Die diskrete Allatom-Molekulardynamik (DMD) wird häufig für biomolekulare Studien verwendet, einschließlich Proteinfaltung, Peptidaggregation38,39,40, Proteinstruktur und -dynamik41,42 sowie Nanopartikel-Protein-Wechselwirkungen21,43,44. DMD ist eine spezielle Klasse der Molekulardynamik (MD), bei der das Kraftfeld als diskrete Schrittfunktionen aus herkömmlichen MD-Simulationen umgestaltet wird45. Konkret bestand das interatomare Potenzial der DMD-Simulationen in dieser Studie aus gebundenen (d. h. Bindungen, Bindungswinkel und Diederwinkel) und nicht gebundenen (d. h. Van-der-Waals-, Elektrostatik-, Solvatisierungs- und Wasserstoffbindungen) Termen . In nicht gebundenen Termen wurden das CHARMM-Kraftfeld46 und die Debye-Hückel-Näherung auf Van-der-Waals-Terme bzw. die elektrostatischen Terme angewendet. Die Lösung in nicht gebundenen Parametern wurde durch das von Lazaridis und Karplus47 entwickelte implizite Lösungsmittelmodell EEF1 verwendet, und die Wasserstoffbindung wurde mit dem reaktionsähnlichen Algorithmus48 modelliert.

Cadherin ist ein kalziumabhängiges Protein, das eines der Hauptproteine ​​für die Zell-Zell-Adhäsion ist. Es ist bekannt, dass das Trans-Dimer durch die Cadherin-Proteine ​​gebildet wird, die aus zwei gegenüberliegenden Zellen stammen, die an der Zell-Zell-Adhäsion beteiligt sind. Wir konzentrierten uns auf die trans-Wechselwirkung, die hauptsächlich durch die domänengetauschte Region in den Domänen der ersten extrazellulären Domäne (EC1) gebildet wurde. Wir verwendeten das EC1-Cadherin-Dimer aus dem Kryo-EM-Modell des EC12-Cadherin-Dimers (PDB-ID: 3PPE49). Um die strukturelle Stabilität des nativen EC1-Dimers sicherzustellen, wurde die domänengetauschte Region einschließlich des N-Terminus (dh Rest 1–5) durch Anlegen des Gō-Potentials eingeschränkt (Abb. 5a). Hier wurden die Gō-Beschränkungen nur zwischen den Cβ-Atomen kontaktierender Reste mit einer schwachen Kontaktenergie von 0,3 kcal/mol (∼0,5 kBT) zugewiesen. Die Ca2+-Koordination der Schleifen (dh der Reste Glu11, Asp62, Glu64, Asp96 und Asp99) wurde durch paarweise Bindungsbeschränkungen zwischen den koordinierten Sauerstoffatomen modelliert. Als nächstes konstruierten wir jeweils einen PS- und PMMA-Nanokunststoff mit Carboxyl-Oberflächengruppen. Eine PS-Kette bestehend aus sich wiederholenden 20 Styrolmonomeren wurde hergestellt und für 50-ns-DMD-Simulationen entspannt und äquilibriert. Sobald die reine PS-Kette ein kompaktes Partikel bildete, wurden der PS-Kette Carboxylgruppen hinzugefügt, gefolgt von 50-ns-DMD-Simulationen. Der PMMA-Nanokunststoff wurde nach der Methode für den PS-Nanokunststoff modelliert. Konstruierte lange PS- und PMMA-Ketten mit Carboxylgruppen, die als kompakte Struktur mit freigelegten Carboxylgruppen erhalten bleiben (Abb. 5b und ergänzende Abb. 16a). Anschließend wurde das Nanoplastik zufällig in der Nähe des EC1-Cadherin-Dimers, mindestens 12 Å entfernt, in einer kubischen Box mit 120 nm3 verteilt, um die Bindungssimulation durchzuführen. Während der Simulationen wurde das Rückgrat des EC1-Dimers eingeschränkt und seine Seitenketten interagierten frei mit den PS- und PMMA-Nanoplastiken. Für die Durchführung von DMD-Simulationen wurden 50 fs/Schritt der Einheitssimulationszeit und 1 kcal/mol entsprechende Energie eingesetzt und mit Andersons Thermostat eine Temperatur von 300 K aufrechterhalten. Wir führten 30 unabhängige DMD-Simulationen für 50 ns und insgesamt 1,5 μs Simulationen durch. Nach den Bindungssimulationen wurden die Bindungsfrequenzen der PS- und PMMA-Nanokunststoffe mit dem EC1-Cadherindimer aus den letzten 20 ns der Simulationen berechnet. Ein Grenzabstand von 0,65 nm wurde zugewiesen, um einen atomaren Kontakt zwischen dem EC1-Cadherindimer und den PS- und PMMA-Nanoplastiken zu erhalten und deren Bindungsfrequenz zu berechnen.

Als nächstes wurden in silico-Experimente mit konstantem Kraftzug an Cadherin-PS- und Cadherin-PMMA-Nanoplastikkomplexen durchgeführt, um die Stabilität des EC1-EC1-Cadherin-Dimers mittels Simulationen der gesteuerten Molekulardynamik (sDMD) zu identifizieren. Die sDMD-Technik ahmt im Allgemeinen optische Pinzetten und Rasterkraftmikroskopie (AFM) nach, um Biomoleküle als Funktion einer konstanten Geschwindigkeit oder einer konstanten Kraft zu charakterisieren. Der sDMD-Simulationsansatz hat die Protein-Ligand-Bindung, Protein-Nanopartikel-Komplexe21,50 und die Proteinentfaltung51 erfolgreich charakterisiert.

Vor den sDMD-Simulationen verteilten wir Chloridionen in der Nähe des Cadherin-PS-Nanoplastikkomplexes, um die Ladungen zu neutralisieren und die Anfangsgeschwindigkeit aller Atome des Systems zu randomisieren. Anschließend immobilisierten wir das Rückgrat eines der EC1-Dimere (mit Ausnahme des domänengetauschten Fragments) und der Rest der Domäne war flexibel (Abb. 5e). Die flexible Domäne des EC1-Cadherin-Dimers wurde durch konstante Kräfte entlang der EC1-zu-EC2-Richtung gezogen, was die Trans-Wechselwirkung des Cadherin-Dimers während der sDMD-Simulationen nachahmte. Die Einzelheiten der Ausführung von sDMD-Simulationen sind dieselben wie bei den verbindlichen DMD-Simulationen. Wir haben 10 pN als Intervallkraft im Bereich von 0 bis 20 pN angewendet. Für eine ausreichende Abtastung wurden 30 Fälle unabhängiger sDMD-Simulationen für jeweils 100 ns durchgeführt. Wir haben pyMol (Schrödinger) verwendet, um die Dissoziationsverläufe von Cadherindimer mit und ohne Nanoplastik zu analysieren.

Die verschiedenen Cadherin-Arten weisen während der Dimerisierung zwei verschiedene intermediäre und domänengetauschte Dimere auf, die als x-Dimer und s-Dimer bekannt sind. Es wurde festgestellt, dass die Dimerwinkel von x-Dimer und s-Dimer aus der Kristallstruktur der Cadherine ∼0 und 90 Grad zueinander betragen21. Wir haben den EC1-Dimerwinkel ohne die angelegte Kraft für die ersten 30 ns der sDMD-Simulationen berechnet, bevor das Dimer zu dissoziieren begann. Berücksichtigt wurden die Skalarprodukte zweier Vektoren zwischen dem 88. und 98. Rest für das S-Dimer und dem 92. und 99. Rest für das X-Dimer sowohl aus der flexiblen als auch der immobilisierten Domäne des EC1-Cadherin-Dimers. Der Dimerwinkel wurde mit MATLAB_R2017a berechnet und die entsprechende Datenanalyse wurde mit Python, Visual Molecular Dynamics (VMD) und Grace durchgeführt.

Ein Gefäßlecktest wurde unter Verwendung von Kaninchen- und Schweinegefäßen als Transwell-Einsätze durchgeführt. Gefäße mit drei 8 Monate alten männlichen großen weißen Schweinen wurden von einem örtlichen Schlachthof in Chongqing, China, beschafft. Gefäße mit drei 4 Monate alten männlichen Neuseeland-Kaninchen wurden von Ensiweier Biotechnology Co, Ltd. (Chongqing, China) bezogen. Gefäße der Koronararterie wurden quer in einzelne Stücke geschnitten und nach Entfernung ihrer ursprünglichen Membranen in eine handelsübliche Transwellkammer gegeben. 0,5 und 5 mg/ml PS-Nanoplastik wurden in die speziell angefertigte Transwell-Vorrichtung für Kaninchen- oder Schweinegefäße gegeben und dann 3 bzw. 6 Stunden lang bei 37 °C inkubiert. Nach der Exposition wurde die PS-Nanoplastik-haltige Lösung verworfen und dann 100 mM EBD (Macklin, China) in jede Vertiefung gegeben und eine weitere Stunde lang inkubiert. Abschließend wurde das Fluoreszenzsignal aus dem unteren Kompartiment des Transwells bei 624 nm mit einem Mikroplatten-Lesegerät quantifiziert. Zur Normalisierung wurden Messwerte der Negativkontrollgruppe verwendet.

Zwölf 10 Wochen alte männliche Schweizer Mäuse wurden von Ensiweier Biotechnology Co, Ltd. (Chongqing, China) erhalten. Männliche Swiss-Mäuse erhielten freien Zugang zu Futter und Wasser und wurden in einer Umgebung mit normaler Temperatur und Luftfeuchtigkeit mit einem Hell-Dunkel-Zyklus von 12 Stunden gehalten. Die Mäuse erhielten einmal eine intravenöse Injektion einer PS-Nanoplastik (1,5, 15 oder 30 mg/kg) enthaltenden 10 mM EBD-Lösung. Die Kontrollmäuse erhielten einmal eine intravenöse Injektion von 10 mM EBD-Lösung. Nach 24 Stunden wurden die Mäuse getötet, um die Organe für die Bildgebung mit dem NEWTON 7.0 Imaging System zu sammeln.

Sechs 10 Wochen alte männliche Schweizer Mäuse wurden von Ensiweier Biotechnology Co, Ltd. (Chongqing, China) erhalten. Alle In-vivo-Mausexperimente wurden gemäß den Richtlinien des NIH für die Pflege und Verwendung von Labortieren durchgeführt und vom Animal Care and Use Committee der Southwest University genehmigt. Männliche Swiss-Mäuse erhielten freien Zugang zu Futter und Wasser und wurden in einer Umgebung mit normaler Temperatur und Luftfeuchtigkeit mit einem Hell-Dunkel-Zyklus von 12 Stunden gehalten. Männliche Swiss-Mäuse erhielten einmalig eine intravenöse Injektion von 10 mM EBD-Lösung. Anschließend wurden die Mäuse mit Isofluran betäubt und subkutan entweder mit PBS oder 30 mg/kg PS-Nanoplastik injiziert. Die Mäuse wurden 15 Minuten, nachdem sie subkutane Injektionen erhalten hatten, durch Genickbruch getötet. Anschließend wurden die Hautbereiche herausgeschnitten, um extravasierten Farbstoff mit entionisiertem Formamid zu extrahieren. Abschließend wurden 100 µL des farbstoffhaltigen Überstands jeder Probe in eine separate Vertiefung einer 96-Well-Platte überführt. Die Fluoreszenzsignale der Proben wurden bei 624 nm mit einem Mikroplatten-Lesegerät quantifiziert.

Die In-vitro-Tests, einschließlich Zelllebensfähigkeit, ROS-Produktion, In-vitro- und Ex-vivo-Transwell-Tests, RNA-Extraktion, Western Blot und konfokale Mikroskopie-Bildgebung, wurden aus mindestens drei biologischen Proben abgeleitet (n = 3). Das Ausmaß der Endothelleckage wurde durch Lückenfläche und -verteilung ausgedrückt, die aus den Bildern mithilfe des trainierbaren Weka-Segmentierungs-Plugins in der ImageJ 1.53c-Software abgeleitet wurden.

Die grafische Darstellung der Daten und die statistische Analyse wurden mit GraphPad Prism Version 9.3.1 (GraphPad Software, La Jolla) und Origin 7.5 durchgeführt. Alle Daten wurden als Mittelwert ± Standardabweichung (SD) ausgedrückt, mittels einfaktorieller oder zweifaktorieller ANOVA analysiert und anschließend mit dem Mehrfachvergleichstest von Tukey durchgeführt, wie in den jeweiligen Bildunterschriften angegeben. P < 0,05 wurde als statistisch signifikant angesehen.

Weitere Informationen zum Forschungsdesign finden Sie in der mit diesem Artikel verlinkten Nature Research Reporting Summary.

Die dem jeweiligen Haupttext zugrunde liegenden Quelldaten (Abb. 1–4, 6) und ergänzenden Abbildungen (Ergänzende Abb. 1, 2, 4, 5, 9–13, 18 und 19) werden als Quelldatendatei bereitgestellt. Quelldaten werden mit diesem Dokument bereitgestellt. Die Quelldaten für Abb. 5 und die ergänzenden Abbildungen 14–17 wurden auf dem Webserver https://dlab.clemson.edu/research/NanoPlasticEL/ hinterlegt. Die Beschreibungsdaten für S-Dimer und X-Dimer wurden in der Protein Data Bank (PDB) unter den Zugangscodes 3PPE und 4ZT1 hinterlegt. Quelldaten werden mit diesem Dokument bereitgestellt.

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Diese Arbeit wurde vom National Key R&D Program of China (2021YFA1200900 CC und PCK), dem Ministerium für Wissenschaft und Technologie der Provinz Guangdong (2019GD0101 CC), der National Natural Science Foundation of China (21976145 YS, 21974110 YS und 82104087 YL) unterstützt. National Science Foundation (CAREER CBET-1553945 FD) und National Institutes of Health (MIRA R35GM119691 FD).

Diese Autoren haben gleichermaßen beigetragen: Wei Wei, Yuhuan Li.

Staatliches Schlüssellabor für Umweltchemie und Ökotoxikologie, Forschungszentrum für Öko-Umweltwissenschaften, Chinesische Akademie der Wissenschaften, Peking, 100085, China

Wei Wei & Yang Lied

Schlüssellabor für Lumineszenzanalyse und molekulare Sensorik, Ministerium für Bildung, College of Pharmaceutical Sciences, Southwest University, 2 Tiansheng Rd, Beibei District, Chongqing, 400715, China

Wei Wei

Leberkrebsinstitut, Zhongshan-Krankenhaus, Fudan-Universität, Shanghai, 200032, China

Yuhuan Li

Arzneimittelabgabe, -disposition und -dynamik, Monash Institute of Pharmaceutical Sciences, Monash University, 381 Royal Parade, Parkville, VIC, 3052, Australien

Yuhuan Li, Nicholas Andricopoulos & Pu Chun Ke

Abteilung für Physik und Astronomie, Clemson University, Clemson, SC, 29634, USA

Myeongsang Lee & Feng Ding

Hochschule für Umweltwissenschaften und -technik, Tongji-Universität, 1239 Siping Road, Shanghai, 200092, China

Sijie Lin

CAS Key Laboratory for Biomedical Effects of Nanomaterials and Nanosafety, National Center for Nanoscience and Technology of China, Peking, 100190, China

Chunying Chen

Abteilung für Chemie- und Biomolekulartechnik, National University of Singapore, 4 Engineering Drive 4, Singapur, 117585, Singapur

David Tai Leong

Nanomedicine Center, The Great Bay Area National Institute for Nanotechnology Innovation, 136 Kaiyuan Avenue, Guangzhou, 510700, China

Pu Chun Ke

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PCK hat das Projekt konzipiert. PCK, DTL, YS, FD, CC und SL trugen zum Projektdesign bei. YL, WW, ML und PCK haben das Manuskript geschrieben. WW und YS führten In-vitro- und Ex-vivo-Transwell-, Signalweg-, ROS-, Autophagie-, Apoptose- und In-vivo-Tests durch. YL und NA führten TEM-, DLS-, Zetapotential-, konfokale Fluoreszenzmikroskopie-, Transwell- und Gap-Area-Analysen durch. ML und FD führten DMD- und sDMD-Simulationen und -Analysen durch. YL führte eine allgemeine experimentelle Datenanalyse und Figurendarstellung durch. Alle Autoren diskutierten und einigten sich auf die Präsentation des Manuskripts.

Entsprechung zu Yang Song oder Pu Chun Ke.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

Nature Communications dankt Elena Del Favero, Guang Wang und den anderen, anonymen Gutachtern für ihren Beitrag zum Peer-Review dieser Arbeit. Peer-Review-Berichte sind verfügbar

Anmerkung des Herausgebers Springer Nature bleibt hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten neutral.

Open Access Dieser Artikel ist unter einer Creative Commons Attribution 4.0 International License lizenziert, die die Nutzung, Weitergabe, Anpassung, Verbreitung und Reproduktion in jedem Medium oder Format erlaubt, sofern Sie den/die ursprünglichen Autor(en) und die Quelle angemessen angeben. Geben Sie einen Link zur Creative Commons-Lizenz an und geben Sie an, ob Änderungen vorgenommen wurden. Die Bilder oder anderes Material Dritter in diesem Artikel sind in der Creative Commons-Lizenz des Artikels enthalten, sofern in der Quellenangabe für das Material nichts anderes angegeben ist. Wenn Material nicht in der Creative-Commons-Lizenz des Artikels enthalten ist und Ihre beabsichtigte Nutzung nicht durch gesetzliche Vorschriften zulässig ist oder über die zulässige Nutzung hinausgeht, müssen Sie die Genehmigung direkt vom Urheberrechtsinhaber einholen. Um eine Kopie dieser Lizenz anzuzeigen, besuchen Sie http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.

Nachdrucke und Genehmigungen

Wei, W., Li, Y., Lee, M. et al. Die Exposition gegenüber anionischem Nanoplastik führt zu einer Undichtigkeit des Endothels. Nat Commun 13, 4757 (2022). https://doi.org/10.1038/s41467-022-32532-5

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Eingegangen: 02. Dezember 2021

Angenommen: 03. August 2022

Veröffentlicht: 13. August 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-022-32532-5

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