Allgemeine Kontrolle Nonderepressible 1 interagiert mit dem kationischen Aminosäuretransporter 1 und beeinflusst die Fruchtbarkeit von Aedes aegypti

May 04, 2023

Parasites & Vectors Band 15, Artikelnummer: 383 (2022) Diesen Artikel zitieren

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Das Aminosäuretransporterprotein Kationischer Aminosäuretransporter 1 (CAT1) ist Teil des Nährstoffsensors im Fettkörper von Mücken. Als Mitglied der SLC7-Familie kationischer Aminosäuretransporter ist es von entscheidender Bedeutung für den Nachweis erhöhter Aminosäurespiegel in der Hämolymphe der Mücke nach einer Blutmahlzeit und den daraus resultierenden Veränderungen der Genexpression im Fettkörper.

Wir führten eine Neuannotation der kationischen Aminosäuretransporter (CATs) von Aedes aegypti durch und wählten den C-terminalen Schwanz von CAT1 aus, um ein Hefe-Zwei-Hybrid-Screening durchzuführen, um mutmaßliche Interaktoren dieses Proteins zu identifizieren. Ein interessantes interagierendes Protein, das wir identifiziert haben, war General Control Nonderepressible 1 (GCN1). Wir haben das Expressionsmuster von GCN1 in mehreren adulten Organen und Strukturen mithilfe von qRT-PCR und Western Blots bestimmt. Schließlich haben wir GCN1 mithilfe doppelsträngiger RNA ausgeschaltet und Veränderungen in nachgeschalteten Signalintermediaten sowie die Auswirkungen des Abbaus auf Vitellogenese und Fruchtbarkeit identifiziert.

In einem Bildschirm für Ae. Aegypti CAT1-interagierende Proteine ​​identifizierten wir GCN1 als mutmaßlichen Interaktor. GCN1 wird in den Eierstöcken und im Fettkörper der Mücke stark exprimiert. Wir liefern Beweise dafür, dass sich die Phosphorylierung der Alpha-Untereinheit (eIF2α) des eukaryotischen Translationsinitiationsfaktors 2 während der Vitellogenese veränderte und dass der Abbau von GCN1 durch RNA-Interferenz in ganzen Mücken die Eikupplungsgröße behandelter Mücken im Vergleich zu Kontrollen verringerte.

Aedes aegypti CAT1 und GCN1 sind wahrscheinlich Interaktionspartner und GCN1 ist wahrscheinlich für die ordnungsgemäße Eientwicklung notwendig. Unsere Daten legen nahe, dass GCN1 Teil eines Nährstoffsensormechanismus in verschiedenen Mückengeweben ist, die an der Vitellogenese beteiligt sind.

Die Fähigkeit, Nährstoffe zu erkennen und Veränderungen im Nährstoffgehalt zu verfolgen, ist für die Zellfunktion und das Überleben sowie für die Aufrechterhaltung der Homöostase in mehrzelligen Organismen von größter Bedeutung. Eukaryotenzellen nutzen eine Vielzahl von Wahrnehmungs- und Signalwegen, um bestimmte Nährstoffkonzentrationen und den Energiestatus zu verfolgen [1]. Aminosäuren sind die Bausteine ​​für alle Proteine, die die Zelle produziert, um die zum Überleben und Wachstum notwendigen Funktionen zu erfüllen. In Eukaryoten wurden zwei konservierte Aminosäure-Sensorwege identifiziert: (i) das mechanistische Ziel des Signalwegs Rapamycin (mTOR) Komplex 1 (mTORC1); und (ii) der allgemeine Aminosäurekontrollweg (GAAC), der erstmals in Hefe beschrieben wurde und bei Säugetieren manchmal als Aminosäurereaktionsweg (AAR) bezeichnet wird [2,3,4]. Beide Wege regulieren die Synthese neuer Proteine ​​als Reaktion auf den Gehalt an freien Aminosäuren in der Zelle, wobei bekannt ist, dass der mTORC1-Weg Input von Wachstumsfaktoren, Energiestatus und Nährstoffverfügbarkeit integriert, um das Zellwachstum zu regulieren [2,3,4,5].

Die Aktivierung von mTORC1 erfolgt durch die Rekrutierung des Komplexes an lysosomale Membranen, wo vorgeschlagen wird, entweder den Gehalt an freien Aminosäuren im Lysosom zu erfassen oder mit anderen Genen für den Aminosäurestoffwechsel im Zytoplasma zu interagieren [2,3,4]. Sobald die TOR-Kinase in mTORC1 aktiviert ist, phosphoryliert sie eine andere Kinase, die ribosomale Protein-S6-Kinase Beta-1 (p70-S6K), die wiederum das ribosomale Protein S6 phosphoryliert und dadurch die Proteinsynthese „einschaltet“ [3, 4, 6]. Die zentrale Kinase im GAAC-Signalweg ist GCN2 (General Control Nonderepressible), die als Reaktion auf mehrere zelluläre Stressfaktoren, einschließlich niedriger intrazellulärer Aminosäurespiegel, aktiviert wird [7,8,9,10,11]. GCN2 erkennt diese Werte mit Hilfe eines anderen Proteins, des General Control Nonderepressible 1 (GCN1), das einen Komplex mit mehreren Proteinen bildet, darunter GCN2, General Control Nonderepressible 20 (GCN20) und Ribosomen, wodurch GCN2 ungeladene Transfer-RNAs (tRNAs) erkennen kann. in der ribosomalen A-Stelle [12,13,14,15] und phosphorylieren als Reaktion die eukaryotische Translationsinitiationsfaktor-2-Untereinheit Alpha (eIF2α) [12,13,14,15,16,17,18]. Die Phosphorylierung von eIF2α führt zu einer Verringerung der allgemeinen Translation und verstärkt die Translation einer Untergruppe von Genen, einschließlich GCN4 (aktiviert bei Säugetieren den Transkriptionsfaktor 4 [aktivierender Transkriptionsfaktor 4]), die auf Aminosäuremangelbedingungen reagieren [19,20,21,22 ]. Es werden Anstrengungen unternommen, um zu verstehen, wie viel Übersprechen zwischen den mTORC1- und GCN2-Signalwegen auftritt [23,24,25,26].

Die weibliche Gelbfiebermücke (Aedes aegypti) ist ein hervorragendes Modellsystem zur Untersuchung von Aminosäure-Signalwegen, die in einer Vielzahl von Organen und Geweben aktiv sind [27, 28]. Weibliche Mücken dieser Art benötigen eine Blutmahlzeit, um die für die Eiproduktion notwendigen Nährstoffe zu gewinnen. Sobald Blut in den Mitteldarm aufgenommen wird, werden Nährstoffe, insbesondere Aminosäuren aus verdauten Blutproteinen, in die Hämolymphe abgegeben, von wo aus sie vom Fettkörper aufgenommen und zur Produktion von Dottervorläuferproteinen (YPPs) verwendet werden. YPPs werden im Fettkörper verarbeitet, in die Hämolymphe sezerniert und von den sich entwickelnden Eizellen über rezeptorvermittelte Endozytose absorbiert. Der entscheidende Prozess der Dotterbildung in den Eiern wird Vitellogenese genannt [29].

Die Aufnahme von Aminosäuren durch den Fettkörper ist für die Initiierung der Vitellogenese unerlässlich, wobei kationische Aminosäuren für die Expression der YPPs unbedingt erforderlich sind [30, 31]. Der Transport kationischer Aminosäuren in den Fettkörper während der Vitellogenese wird durch Proteine ​​der Solute Carrier Family 7 (SLC7) erleichtert, darunter die heterodimeren Aminosäuretransporter (HATs) und die kationischen Aminosäuretransporter (CATs) [32]. CAT-Proteine ​​sind Transzeptoren mit 14 Transmembrandomänen, d und X) [34]. Es wurde gezeigt, dass CATs eine wichtige Rolle bei Ae spielen. aegypti YPP-Synthese während der Vitellogenese, wie durch RNA-Interferenz (RNAi)-Knockdown gezeigt [32]. Fünf CAT-Proteine ​​wurden in Ae klassifiziert. aegypti [32] und die Substratspezifität und Transportdynamik von zwei davon wurden charakterisiert [30, 35, 36]. Aedes aegypti CAT 1 (AaCAT1) transportiert selektiv Histidin [36], während Ae. Aegypti CAT 3 (AaCAT3) fungiert als allgemeinerer Transzeptor für kationische Aminosäuren und zeigt eine leichte Präferenz für Arginin [35]. Die Substratprofile der übrigen AaCATs wurden nicht klassifiziert.

Es wurde bereits gezeigt, dass Mitglieder der CAT-Familie Teil des mTOR-Signalwegs sind. RNAi-Knockdown von Ae. aegypti CAT 2 (AaCAT2) und AaCAT3 reduzierten die Mengen an phosphoryliertem p70-S6K nach Stimulation kultivierter Fettkörper mit Aminosäuren signifikant [32]. Während der Zusammenhang zwischen der CAT-vermittelten Aminosäureaufnahme und der mTOR-Regulation der YPP-Genexpression im Fettkörper von Ae. aegypti ist fest etabliert, es gibt jedoch noch keinen experimentell etablierten Signalvermittler zwischen CATs und dem mTOR-Nährstoffsensor.

Hier präsentieren wir Beweise dafür, dass AaCAT1 mit GCN1 in Ae interagiert. aegypti, und dass der GCN1-Knockdown die Nährstoffsignalisierung und die Entwicklung von Mücken-Oozyten beeinflusst.

Für alle Experimente wurden Aedes aegypti-Mücken (Liverpool-Stamm) verwendet. Die Eier wurden vor dem Schlüpfen mindestens eine Woche lang in 13 × 20-Zoll-Behältern getrocknet. Pfannen, in entionisiertem Wasser bei 27 °C. Die Larven wurden alle 3 Tage mit speziellen Kitty-Trockenfutterpellets für Katzen (Walmart Stores Inc., Bentonville, AR, USA) gefüttert und das Wasser in jeder Pfanne wurde alle 5 Tage gewechselt. Die Puppen wurden in Schalen aufgeteilt und in Bug Dorm-1-Insektenaufzuchtkäfigen (30 × 30 × 30 cm; Bugdorm, Taichung, Taiwan) gelagert und durften schlüpfen. Erwachsene Mücken wurden in ihren Bug Dorm-Käfigen unter kontrollierten Bedingungen (27 ° C, 80 % Luftfeuchtigkeit, 14:10 h Licht-Dunkel-Zyklus) gehalten und ad libitum mit 20 % Saccharoselösungen gefüttert. Für alle Experimente wurden erwachsene Weibchen 5 bis 7 Tage nach der Eklosion verwendet.

Auf die CAT-Proteinsequenzen von Aedes aegypti wurde aus einer früheren Veröffentlichung (32) und aus der Proteindatenbank des National Center for Biotechnology Information (NCBI) zugegriffen. Der Zugriff auf die Proteinsequenzen von Drosophila melanogaster erfolgte über die FlyBase-Version FB2021_04 [37]. Alle Ae. Aegypti- und D. melanogaster-Proteinsequenzen wurden mit der MEGA-Software (Molecular Evolutionary Genetics Analysis), Version 11 (38), unter Verwendung der Standardeinstellungen abgeglichen, und ein Nachbarverknüpfungsbaum wurde unter Verwendung der Standardeinstellungen in MEGA 11 erstellt. Knoten, die Transkriptvarianten oder homologe Sequenzen enthalten wurden ausgeblendet und relevante Anmerkungsinformationen wurden manuell zum Baum hinzugefügt.

Flügel, Beine und Köpfe von 100 mit Blut gefütterten weiblichen erwachsenen Mücken wurden entfernt und entsorgt. Das verbleibende Gewebe wurde in 2-ml-Eppendorf-Röhrchen mit 0,5 ml TRIzol®-Reagenz (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) gegeben. Das Gewebe wurde unter Verwendung eines VWR-Akkumotors (VWR, Avantor; Radnor, PA, USA; Kat.-Nr. 4774-370) mit Einweg-Polybutylenterephthalat-Pistillen (VWR, Avantor; Kat.-Nr. 4774-358) und weiteren 0,5 ml homogenisiert TRIzol wurde zugegeben, bevor die Röhrchen durch Umdrehen gemischt wurden. Die Gesamt-RNA wurde mithilfe des Protokolls „RNA-Isolierung mit TRIzol:Chloroform“ isoliert und präzipitiert. Nach der Phasentrennung wurde die wässrige Phase, die die Gesamt-RNA enthielt, abgetrennt und ein äquivalentes Volumen 100 % Ethanol zur wässrigen Phase gegeben und gemischt. Anschließend wurden die Proben mit einem Zymo RNA Clean and Concentrator 100 Kit (Zymo Research, Irvine, CA, USA; Kat.-Nr. R1019) gereinigt und eine DNase-Behandlung in der Säule durchgeführt, um genomische DNA zu entfernen. Die Anreicherung der Messenger-RNA (mRNA) wurde unter Verwendung des Protokolls zur Reinigung polyadenylierter RNA von Takara (Takara Bio USA Inc., San Jose, CA, USA) durchgeführt. Anschließend wurden die RNA-Konzentrationen mit einem Nanodrop™ 1000-Spektrophotometer (Thermo Fisher Scientific) gemessen.

Komplementäre DNA-Bibliotheken (cDNA-Bibliotheken) wurden unter Verwendung des Make Your Own „Mate & Plate“-Bibliothekssystems (Takara Bio USA Inc.) gemäß den Anweisungen des Herstellers erstellt. Kurz gesagt, 2 µl gereinigte RNA-Probe, 1 µl oligomerisierte Desoxythymidin (Oligo-dT)-Primerlösung (CDSIII) und 1 µl entionisiertes Wasser wurden 2 Minuten lang bei 72 °C inkubiert und dann 2 Minuten lang auf Eis gekühlt, bevor sie zentrifugiert wurden kurzzeitig bei 14.000 g für 10 s absinken. Um die Reaktionsmischung zu vervollständigen, wurden der Lösung 2,0 µl 5× Erststrang-Pufferlösung, 1,0 µl Dithiothreitol (DTT; 100 mM), 1,0 µl Desoxyribonukleosidtriphosphat (NTP)-Mischung (10 mM) und 1,0 µl SMART MMLV Reverse Transkriptase zugesetzt . Die resultierende Reaktionsmischung wurde 10 Minuten lang bei 42 °C inkubiert, bevor 1 µl SMART III-modifiziertes Oligo-dT zugegeben wurde. Anschließend wurde die Lösung gemischt und 1 Stunde bei 42 °C inkubiert. Die Reaktionsmischung wurde 10 Minuten lang auf 75 °C erhitzt, um die Synthese des ersten Strangs zu beenden, und dann auf Raumtemperatur abgekühlt. Abschließend wurde 1 µl RNase H zum Reaktionsgemisch gegeben, das 20 Minuten bei 37 °C inkubiert wurde.

Die cDNA-Bibliothek wurde durch Langstrecken-PCR-Amplifikation unter Verwendung des Advantage 2 Polymerase Mix (Takara Bio USA Inc.) generiert. Der Reaktionsmix bestand aus 2 µl Erststrang-cDNA, 70 µl entionisiertem Wasser, 10 µl 10× Advantage 2 PCR-Puffer, 2 µl 50× dNTP-Mix, 2 µl 5'-PCR-Primer, 2 µl 3'-PCR-Primer, 10 µl 10 × Schmelzlösung und 2 µl 50× Advantage 2 Polymerase Mix. Die Amplifikation wurde in einem Eppendorf EPgradient MasterCycler (Eppendorf North America, Enfield, CT, USA) unter Anwendung der folgenden Zyklusparameter durchgeführt: 95 °C für 30 s; dann 26 Zyklen von 95 °C für 10 s und 68 °C für 6 min; mit einem letzten Zyklus bei 68 °C für 5 Minuten.

Membrantopologie des Ae. Das Aegypti-AaCAT1-Protein (XP_021707900.1) wurde mit dem Transmembran-Vorhersagetool ExPASy TMHMM v2.0 (39) und dem Transmembran-Vorhersagetool Protter (40) vorhergesagt, was zur Identifizierung des N-Terminus, des C-Terminus und der intrazellulären Regionen führte. Die TBLASTN-Funktion des NCBI BLAST-Programms (41) wurde verwendet, um die Nukleotidsequenz der C-terminalen intrazellulären Sequenz in Ae zu identifizieren. Verwendung des Aegypti-Codons. Primer, die die C-terminale intrazelluläre Sequenz flankieren, wurden mit NCBI Primer-BLAST [42] entworfen und mit NetPrimer (http://www.premierbiosoft.com/netprimer/) kreuzvalidiert. Den Enden der Vorwärts- und Rückwärtsprimer wurden Adaptersequenzen hinzugefügt, wie im Matchmaker Gold Yeast Two-Hybrid Kit (Takara Bio USA Inc.) angegeben, um die Insertion des Köderfragments in das pGBKT7-Köderplasmid zur Verwendung in der Matchmaker Gold Yeast sicherzustellen Zwei-Hybrid-Kit. Vollständige Primersequenzen (mit kursiv markierten Adapterregionen) sind wie folgt: vorwärts – 5′-CATGGAGGCCGAATTCCATTCGGTTCTTGGCTCCGGTAGT-3′; Rückseite – 5′-GCAGGTCGACGGATCCTACGCCTTTTCGAGTCCTACCATG-3′.

Die PCR zur Erzeugung des AaCAT1-Köderfragments wurde mit einem Eppendorf EPgradient Mastercycler (Eppendorf North America) durchgeführt, um das Köderfragment für das Zwei-Hybrid-Screening zu erzeugen. Die Köderprimer wurden in der Reaktion verwendet, wobei die im vorherigen Schritt erzeugten cDNA-Bibliotheken als Matrize fungierten. Das In-Fusion HD Cloning Kit (Takara Bio USA Inc.) wurde verwendet, um die kurzen und langen Fragmente in den pGBKT7-Plasmidvektor zu klonen. Anschließend wurde das Yeastmaker Yeast Transformation System 2 Kit (Takara Bio USA Inc.) verwendet, um die Köderplasmide gemäß den Anweisungen des Herstellers in kompetente Hefezellen des Y2HGold-Stamms zu transformieren.

Kompetente Hefezellen des Stammes YI87 wurden zunächst gemäß dem Hefetransformationsprotokoll im Yeastmaker Yeast Transformation System 2 (Takara Bio USA Inc.) hergestellt. Anschließend wurde das Make Your Own „Mate & Plate“-Bibliothekssystem (Takara Bio USA Inc.) verwendet, um den Aufbau der Zwei-Hybrid-Bibliothek gemäß den Anweisungen des Herstellers abzuschließen.

Das Matchmaker Gold Yeast Two-Hybrid System (Takara Bio USA Inc.) wurde verwendet, um die Köderhefestämme (Y2HGold) und Beutehefestämme (Y187) gemäß den Anweisungen des Herstellers zu paaren. Anschließend wurden verpaarte Hefen auf einem synthetisch definierten (SD) Wachstumsmedium ohne Leucin und Tryptophan (Double Drop Out [DDO]-Medien) ausplattiert, das mit Aureobasidin und X-alpha-Gal, einem chromogenen Substrat des Enzyms α-Galactosidase, ergänzt war.

Um mögliche falsch positive Ergebnisse auszuschließen, wurden blaue Kolonien gepickt und auf frisches DDO ohne Adenin und Histidin aufgetragen (Quadruple Drop Out [QDO]-Medien). Gepatchte Kolonien wurden 3 Tage lang auf QDO-Medium gezüchtet, bevor eine weitere Selektionsrunde auf blaue Kolonien folgte. Da Hefe mehrere unterschiedliche Plasmide tragen kann, war es notwendig, alle nicht interagierenden Beuteplasmide auszuwählen, die nach dem Wachstum auf QDO-Medien möglicherweise von blauen Kolonien beherbergt werden. Zu diesem Zweck wurden blaue Kolonien aus QDO-Medien gepflückt und auf frische DDO-Medien gepatcht. Die Kolonien wurden zweimal auf frische DDO-Medien aufgetragen und nur die blauen Kolonien am Ende dieser Selektion wurden zur Analyse möglicher Wechselwirkungen behalten.

Nach zwei Selektionsrunden auf DDO wurde die Beuteinsertzusammensetzung der verbleibenden blauen Kolonien durch Kolonie-PCR unter Verwendung des Matchmaker Insert Check PCR Mix 2 (Takara Bio USA Inc.) überprüft. PCR-Produkte wurden durch Elektrophorese auf einem 1 % Tris-Acetat-Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA)-Puffer (TAE)-Agarose/SYBR Safe-Gel analysiert. Das Auftreten von mehr als einer Bande war ein Hinweis auf das Vorhandensein von mehr als einem Beuteplasmid in einer Zelle. PCR-Produkte, die einzelne Banden erzeugten, wurden gereinigt und zur Sequenzierung an Molecular Cloning Laboratories (MCLAB) geschickt. NCBI BLAST [43] wurde zur Identifizierung des Ae verwendet. Aegypti-Gensequenzen, die den Prey-Plasmidsequenzdaten entsprechen. Aus diesem Datensatz wurde eine Reihe mutmaßlicher AaCAT1-Interaktoren ausgewählt, indem offensichtlich falsch positive Ergebnisse entfernt wurden, wie z. B. Kolonien, die Plasmide ohne bekannte Mückeninsertion enthielten, und Interaktoren, von denen bekannt ist, dass sie sich im Zytosol und in der Plasmamembran lokalisieren, wurden ausgewählt, da diese beiden Stellen die Regionen darstellen wo Proteine ​​am wahrscheinlichsten mit AaCAT1 interagieren.

Die Proteinisolierung aus Mücken in den hier beschriebenen Experimenten wurde wie folgt durchgeführt. Den Mücken wurden Beine, Köpfe und Flügel entnommen und die Strukturen nach Bedarf für jeden in den Ergebnissen beschriebenen Test zerlegt. Präparierte Organe und Strukturen wurden unter Verwendung eines VWR-Akkumotors (VWR, Avantor; Kat.-Nr. 4774-370) mit Einweg-Polybutylenterephthalat-Pistillen (VWR, Avantor; Kat.-Nr. 4774-358) in 100 µl Lysepuffer (50) homogenisiert mM Tris, pH 7,4; 1 % Octylphenoxypoly(ethylenoxy)ethanol, verzweigt [IGEPAL]; 0,25 % Natriumdesoxycholat; 150 mM NaCl; 1 mM EDTA), ergänzt mit jeweils 1 µl HALT™ Protease-Inhibitor-Cocktail und HALT™ Phosphatase-Inhibitor-Cocktail (beide von Thermo Fisher Scientific). Homogenisierte Proben wurden 10 Minuten lang bei 12.700 U/min und 4 °C zentrifugiert, um die Trümmer zu pelletieren. Der proteinhaltige Überstand wurde gesammelt und die Proteinkonzentration mit einem Pierce™ BCA Protein Assay Kit (Thermo Fisher Scientific) auf einem NanoDrop™ 1000 Spektrophotometer (Thermo Fisher Scientific) unter Verwendung des Protein BCA-Programms bestimmt.

Ein mit 6-Histidin (6-His) markiertes C-terminales AaCAT1-Köderfragment ([NH2]HHHHHHHSVLGSGSQTLSESQLENPFCMVGLEKA[COOH]) wurde individuell synthetisiert (Pierce Biotechnology, Thermo Fisher Scientific) und in Verbindung mit einem Pierce™ Pull-Down PolyHis-Protein verwendet :Protein Interaction Kit (Pierce Biotechnology, Thermo Scientific) mit mehreren Modifikationen.

Eine Reihe von Proteinproben wurde vor dem Herunterziehen mit dem 6-His-markierten AaCAT1-Köder vernetzt. Kurz gesagt, 1 mg Disuccinimidylsulfoxid (DSSO)-Vernetzer wurde in 51,5 µl Dimethylsulfoxid (DMSO) gelöst, um eine 50 mM Stammlösung herzustellen. Als nächstes wurden etwa 800 µg Gesamtproteinisolat aus Fettkörpern mit 6-His-markiertem CAT1-C-Terminus in einer Konzentration von 200 µg/ml in Tris-gepufferter Kochsalzlösung (TBS) gemischt, um zwei Fettkörperproben zu erzeugen. Ein 50-µl-Aliquot des gelösten Vernetzers wurde zu einer Fettkörperprobe gegeben, und 50 µl DMSO wurden zu einem nicht vernetzten Fettkörper als Kontrolle gegeben. Die Proben wurden über Nacht bei 4 °C inkubiert, um die Vernetzung vor der Verwendung in Pull-Down-Reaktionen zu erleichtern. Für den Proteinabbau wurden 500 µl His-Pur-Kobaltharz pro Probe 2 Minuten lang bei 700 g und Raumtemperatur zentrifugiert und der Überstand vom Harzbett entfernt. Als nächstes wurde das Harz in 500 µl Waschpuffer (1:1-Mischung aus TBS:Pierce Lysis-Puffer plus 5 mM Imidazol) äquilibriert und mit den gleichen Einstellungen wie oben zentrifugiert. Der Waschpuffer wurde entfernt und die Proteinproben wurden dem Harz zugesetzt und bei Raumtemperatur unter leichtem Schütteln eine Stunde lang gemischt, um die Bindung vernetzter 6-His-markierter Proteine ​​an die His-Pur-Harzkügelchen zu erleichtern. Nach dem Mischen wurden die Proben wie oben zentrifugiert und der Überstand gesammelt und aufbewahrt. Die Perlen wurden dreimal mit jeweils 200 µl Waschpuffer gewaschen, und nach jedem Waschen wurden die Proben wie oben beschrieben zentrifugiert und der Überstand jedes Mal gesammelt und aufbewahrt. Abschließend wurden die gebundenen Proteine ​​in 100 µl Elutionspuffer (Waschpuffer mit 290 mM Imidazol) eluiert. Nachdem die Perlen im Elutionspuffer resuspendiert wurden, wurden die Proben wie oben beschrieben zentrifugiert und der Überstand gesammelt.

Ein zweiter Satz Proteinproben wurde ohne Vernetzung entnommen. Kurz gesagt, drei 1,7-ml-Eppendorf-Röhrchen (nur Köderkontrolle, Harzkontrolle und Pulldown) wurden jeweils mit 200 µl HisPure Cobalt Resin gefüllt und mit fünf Waschgängen mit 1,2 ml Waschlösung (1:1-Mischung aus TBS: Pierce-Lysepuffer plus 5 mM Imidazol). Ungefähr 500 µg Köderprotein wurden in die Nur-Köder-Kontroll- und Pulldown-Röhrchen gegeben, und ein äquivalentes Volumen an Waschlösung wurde in das Harz-Kontrollröhrchen gegeben. Alle Röhrchen wurden bei 4 °C unter leichtem Schütteln 2 Stunden lang inkubiert, um die Bindung von 6-His-markierten Köderpeptiden an das HisPure Cobalt Resin zu erleichtern. Nach der Inkubation wurde der Überstand entfernt und die Perlen einmal mit 400 µl Waschlösung gewaschen. Ungefähr 2 mg Gesamtproteinlysat (Protokoll zur Proteinextraktion siehe oben) wurden sowohl in die Harzkontrolle als auch in die Pull-Down-Röhrchen gegeben, und ein äquivalentes Volumen an Waschlösung wurde in das Nur-Köder-Kontrollröhrchen gegeben. Alle Röhrchen wurden über Nacht bei 4 °C unter leichtem Schütteln inkubiert, um die Interaktion zwischen immobilisierten Köder- und Beuteproteinen zu erleichtern. Am folgenden Tag wurden die Perlen auf die bereitgestellten Spinsäulen übertragen und der Durchfluss jeder Probe nach der Zentrifugation gesammelt. Jeder Säule wurde Waschpuffer (250 µl) mit 290 mM Imidazol zugesetzt, und die Säulen wurden 5 Minuten lang bei Raumtemperatur unter leichtem Schütteln inkubiert, gefolgt von einer Zentrifugation, um die eluierten Proteine ​​zu sammeln.

T7-konjugierte doppelsträngige RNA (dsRNA)-Primer für Ae. aegypti GCN1 wurde aus mRNA entworfen (GenBank-Referenzsequenzzugang: XM_001651776.2), und dsRNA-Primer für grün fluoreszierendes Protein (GFP) wurden einer früheren Studie entnommen (44) (Tabelle 1). Gesamt-Ae. Aegypti-cDNA und ein GFP-haltiges Plasmid (3′ EGFP pXOON) wurden als Matrizen verwendet, um T7-markierte dsDNA zur Verwendung in der dsRNA-Synthese unter Verwendung des Megascript™ RNAi Kit (Thermo Fisher Scientific) gemäß den Anweisungen des Herstellers herzustellen. Erwachsenen weiblichen Mücken wurde auf oralem Weg 1 µl von etwa 1 µg/µl dsRNA intrathorakal unter Verwendung von gezogenen Glaskapillaren injiziert und ihnen wurde eine Stunde Zeit gegeben, sich in Bug Dorm-1-Insektenaufzuchtkäfigen mit 20 % Saccharose zu erholen. Nach einer Stunde wurden alle Mücken, die sich nicht erholt hatten, verworfen. Überlebende injizierte Mücken wurden unter den oben beschriebenen Aufzuchtbedingungen bis zur Verwendung in nachfolgenden Experimenten gehalten. Alle Injektionen wurden 5–7 Tage nach der Eklosion bei Weibchen durchgeführt, um das Mückenalter mit allen anderen durchgeführten Experimenten zu standardisieren.

Das Gesamtprotein wurde für jeden Test wie oben beschrieben aus Pools verschiedener Organe oder Strukturen isoliert. Das Gesamtprotein wurde mit einem äquivalenten Volumen von 1:1 Laemmli-Puffer:Beta-Mercaptoethanol gemischt und 10 Minuten lang auf 95 °C erhitzt, um die Proteine ​​zu denaturieren. Die Proben wurden in 7,5 % Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophoresegele (SDS-PAGE) (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA) geladen und 90 Minuten (GCN1) bzw. 60 Minuten (alle anderen Proteine) bei 100 V betrieben ) unter Verwendung einer PowerPac™ HC-Stromquelle (Bio-Rad Laboratories) zur Trennung von Proteinen. Die Proteine ​​wurden mithilfe vorbereiteter Transferstapel (Bio-Rad Laboratories) in einem Trans-Blot® Turbo™ Transfersystem (Bio-Rad Laboratories) vom Gel auf Polyvinylidendifluorid (PVDF)-Membranen übertragen, wobei der standardmäßig voreingestellte Transfer auf 30 Minuten erfolgte laufen. PVDF-Membranen wurden dreimal 5 Minuten lang in 1 × TBS + 0,05 % Tween-20 (TBST) gewaschen und 1 Stunde lang bei Raumtemperatur unter leichtem Schütteln in StartingBlock™ T20 (TBS) (Thermo Fisher Scientific) blockiert. Die Membranen wurden mit primärem Antikörper (Tabelle 2), verdünnt in Blockierungspuffer, über Nacht bei 4 °C unter leichtem Schütteln inkubiert, gefolgt von drei Waschungen für jeweils 5 Minuten in TBST und anschließender Inkubation mit einem geeigneten sekundären Antikörper (Tabelle 2), verdünnt in Blockierungspuffer 1 Stunde bei Raumtemperatur unter leichtem Schütteln. Die Membranen wurden dann 5 Mal jeweils 5 Minuten lang in TBST gewaschen, um alle freien Sekundärantikörper zu entfernen, und dann in Pierce 1-Step TMB-Blotting Substrate Solution (Thermo Fisher Scientific) für den kolorimetrischen Nachweis bis zu 30 Minuten bei Raumtemperatur mit inkubiert sanftes Schaukeln. Alternativ wurden die Blots 5 Minuten lang bei Raumtemperatur in Li-Cor WesternSure® PREMIUM Chemiluminescent Substrate (Li-Cor, Lincoln, NE, USA) inkubiert, woraufhin die gefärbten Membranen mit einem C-DiGit Blot Scanner (Li-Cor, Lincoln, NE, USA) abgebildet wurden. Cor) und Image Studio™-Software (Li-Cor); Mit dieser Software wurden Pixelintensitäten für semiquantitative Densitometriemessungen bestimmt.

Mückenorgane und -strukturen wurden präpariert und die Gesamt-RNA wurde mit einem Qiagen RNeasy Mini Kit (Qiagen, Hilden, Deutschland) extrahiert. Zehn Organe und Strukturen wurden gepoolt, um einzelne Proben zu generieren, und für alle quantitativen Reverse-Transkriptions-PCR-Experimente (qRT-PCR) wurde eine Probengröße von drei verwendet. Die Konzentrationen von RNA und potenzieller genomischer DNA wurden mit einem Qbit 2.0 (Invitrogen, Thermo Fisher Scientific) gemessen und die RNA-Qualität wurde mit einem NanoDrop 1000-Spektrophotometer (Thermo Fisher Scientific) bestätigt. Ein 250-ng-Aliquot RNA aus jeder Probe wurde mit iScript™ Reverse Transcription Supermix für RT-qPCR (Bio-Rad Laboratories) revers transkribiert, um cDNA zu erzeugen. Um das Fehlen einer genomischen DNA-Kontamination zu bestätigen, wurden nicht revers transkribierte (noRT) Proben mit iScript™ noRT Supermix (Bio-Rad Laboratories) erstellt. Primer für gcn1 wurden mit PrimerBLAST [42] entworfen und mit NetPrimer (Premier Biosoft, Palo Alto, CA, USA) bewertet. Primer wurden entwickelt, um Intronsequenzen zu flankieren, um zwischen mRNA- und genomischen DNA-Amplifikationsprodukten zu unterscheiden. Primer für die Gene Vitellogenin (vg), Beta-Actin (β-Actin) und ribosomales Protein S7 (rps7) wurden bereits veröffentlicht (45, 46) (siehe Tabelle 3 für alle Primersequenzen). Alle qRT-PCR-Primer wurden im 10-nmol-Maßstab mit standardmäßiger Entsalzungsreinigung (Eurofins Genomics, Louisville, KY, USA) synthetisiert.

Da die Referenzgenexpression zwischen verschiedenen Organen oder an verschiedenen Punkten während der Vitellogenese unterschiedlich sein kann, wurde das Tool RefFinder [47] verwendet, um das am stabilsten exprimierte Referenzgen für jeden qRT-PCR-Assay zu identifizieren. Für die Profilierung der gcn1-Expression in erwachsenen Organen und Strukturen wurde rps7 als geeignete Referenz bestimmt, während β-Actin als geeignete Referenz für die Untersuchung der vg-Transkription nach RNAi-Behandlung bestimmt wurde. Alle qRT-PCR-Läufe wurden durchgeführt, indem cDNA 1:1 in nukleasefreiem Wasser verdünnt und die folgenden Komponenten in klaren 96-Well-Platten (Genesee Scientific, El Cajon, CA, USA) auf Eis gemischt wurden: 5 µl iTaq Universal SYBRgreen Supermix ( Bio-Rad Laboratories), 1 µl 1:1 gemischte vorwärts- und rückwärtsgenspezifische Primer, 1 µl verdünnte cDNA und 2 µl nukleasefreies Wasser. Die Platten wurden kurz heruntergeschleudert, um das gesamte Material am Boden der Vertiefungen zu sammeln, und mit ThermalSeal RTS™ durchsichtiger Kunststoffklebefolie (Excel Scientific Inc., Victorville, CA, USA) versiegelt. Alle qRT-PCR-Assays wurden auf einem CFX96 Touch Real-Time PCR Detection System (Bio-Rad Laboratories) durchgeführt, das von einem Computer unter Verwendung der CFX Maestro-Software (Bio-Rad Laboratories) und dem folgenden Zyklusprofil gesteuert wurde: eine anfängliche Denaturierung bei 95 °C für 30 s; gefolgt von 40 Denaturierungszyklen bei 95 °C für 5 Sekunden und einer kombinierten Temperung/Verlängerung bei 60 °C für 30 Sekunden. Nach jedem Dehnungsschritt wurde eine Fluoreszenzmessung durchgeführt. Unmittelbar nach jeder qRT-PCR wurden Schmelzkurven von 65 °C bis 95 °C in Schritten von 0,5 °C mit einer Haltezeit von 5 Sekunden bei jedem Schritt erstellt. Die Effizienz der Primerpaaramplifikation wurde anhand der Rohfluoreszenzdaten im Real-Time PCR Miner-Tool bestimmt [48]. Die durchschnittlichen Quantifizierungszykluswerte (Cq) aus technischen Replikaten jeder Probe wurden unter Verwendung der mit dem Real-Time PCR Miner-Tool bestimmten Primerpaareffizienzen analysiert, und die Cq-Werte von gcn1 oder vg wurden auf die Cq-Werte von rps7 bzw. β-Actin normalisiert Quantifizierung von Veränderungen in der Genexpression.

Gruppen weiblicher Ae. Aegypti (5–7 Tage nach der Eklosion) wurde entweder GCN1-dsRNA oder GFP-dsRNA injiziert, wie im obigen Text beschrieben. Fünf Tage nach der Injektion (PI) wurden überlebende Mücken beider Gruppen 1 Stunde lang mit auf 37 °C erwärmtem defibriniertem Rinderblut (HemoStat Laboratories, Dixon, CA, USA) mit Blut gefüttert. Einzelne vollgestopfte Mücken wurden in Eierablagekammern gebracht und 96 Stunden lang unter den oben beschriebenen Aufzuchtbedingungen gehalten, um sicherzustellen, dass ihnen ausreichend Zeit zum Abschluss der Vitellogenese und Eiablage blieb. Eipapiere aus jeder Eikammer wurden gesammelt und 96 Stunden lang getrocknet, bevor sie zur Bestimmung der durchschnittlichen Gelegegrößen aus jeder Behandlung gezählt wurden. Nach der Zählung wurden die Eier mindestens weitere 72 Stunden lang getrocknet (insgesamt mindestens eine Woche Trocknungszeit). Um die Schlupfraten zu bestimmen, wurden 12 Eierpapiere aus jeder Behandlung nach dem Zufallsprinzip ausgewählt und in kleine Schalen mit entionisiertem Wasser und einem Viertel Pellet Katzenfutter „Special Kitty“ (Walmart Stores Inc.) gelegt und schlüpfen gelassen. Die Larvenzahlen aus jedem Gelege wurden mit der Anzahl der in jedem Gelege gezählten Eier verglichen, um die Schlupfraten zu berechnen.

Weiblichen Mücken wurde 5–7 Tage nach der Eklosion entweder GFP- oder GCN1-dsRNA wie oben beschrieben injiziert. Am 5. Tag PI erhielten weibliche Mücken eine Blutmahlzeit und durften eine Stunde lang fressen. Unmittelbar vor der Blutfütterung wurde eine Gruppe injizierter Weibchen isoliert, um sie als nicht gefütterte Basisprobe zu verwenden. Gruppen von 10 mit Blut gefütterten Mücken wurden 24, 48 und 72 Stunden nach der Blutmahlzeit (PBM) beprobt. Mücken aus jeder der beiden Injektionsbehandlungen (GFP- oder GCN1-dsRNA) und zu vier Zeitpunkten (ungefüttert, 24-Stunden-PBM, 48-Stunden-PBM, 72-Stunden-PBM) wurden auf Eis anästhesiert und ihre Eierstöcke wurden präpariert. Beide Eierstöcke jeder Mücke (n = 10) wurden gemessen und gemittelt, um die durchschnittliche Eierstocklänge pro Mücke für jede Behandlung und jeden Zeitpunkt zu bestimmen. Fünf Eizellen pro Mücke (n = 10) wurden gemessen, um die durchschnittliche Eizellenlänge jeder Mücke für jeden Behandlungstyp und jeden Zeitpunkt zu bestimmen.

Vor der Auswahl zusätzlicher statistischer Tests wurden Normalitätstests der Verteilungen aller Daten mithilfe von Shapiro-Wilk-Tests und QQ-Plots durchgeführt. GCN1-qRT-PCR-Daten aus erwachsenen weiblichen Organen und Strukturen wurden mithilfe einer Einweg-Varianzanalyse (ANOVA) analysiert und signifikante Unterschiede zwischen den Proben wurden mithilfe eines Tukey-HSD-Post-hoc-Tests bestimmt. Unterschiede in den phosphorylierten eIF2α-Spiegeln zwischen GCN1- und GFP-dsRNA-injizierten Proben zu unterschiedlichen Zeitpunkten (PBM), gemessen durch Western-Blot-Banden-Densitometrie, wurden unter Verwendung einer Einweg-ANOVA gefolgt von einem Tukey-HSD-Post-hoc-Test analysiert, um signifikante Unterschiede zwischen den Behandlungen zu jedem Zeitpunkt zu identifizieren . Unterschiede in der vg-Expression zwischen GCN1- und GFP-dsRNA-injizierten Proben, gemessen durch qRT-PCR, wurden zu jedem Zeitpunkt mithilfe ungepaarter t-Tests analysiert. Unterschiede in der Eierstock- und Eizellenlänge von Mücken, denen GCN1- und GFP-dsRNA injiziert worden waren, wurden zu jedem Zeitpunkt auch mithilfe ungepaarter t-Tests analysiert. Unterschiede in der Eizahl und den Schlupfraten wurden mithilfe von Mann-Whitney-U-Tests analysiert. Die Überlebenskurven dsRNA-injizierter Mücken wurden mithilfe eines Log-Rank-Mantel-Cox-Tests analysiert. P-Werte < 0,05 galten für alle Tests als statistisch signifikant. Alle statistischen Analysen wurden mit der statistischen Analysesoftware Prism 8 (GraphPad Software, San Diego, CA, USA) durchgeführt.

In früheren Veröffentlichungen haben wir die vollständige SLC7-Genfamilie in Ae kommentiert. aegypti [32] und identifizierte die Substrataffinitäten und Transportaktivitäten von zwei der fünf annotierten CATs [35, 36]. Im Anschluss an diese Studien wurden neue Genomanmerkungen für Ae veröffentlicht. aegypti [49, 50]. Da einige dieser automatischen Annotationen bestimmten CATs inkonsistente Nummern zugewiesen haben, haben wir uns entschieden, unsere vorherigen CAT-Datensätze [32] mit den aktuellen Annotationen, die in Entrez Gene verfügbar sind, und mit den aktuellen D. melanogaster-CAT-Gruppen aus der FlyBase-Version FB2021_04 [32] neu zu kommentieren. 37] für den evolutionären Kontext (siehe Zusatzdatei 1: Tabelle S1). Die Ausrichtung mehrerer Proteine ​​in MEGA11 [38] ergab, dass sich sowohl AaCAT1 als auch AaCAT3 am nächsten an D. melanogaster Slimfast (Slif) anhäufen (Abb. 1a) und somit wahrscheinlich eine Genduplikation eines gemeinsamen Vorfahren nach der evolutionären Spaltung zwischen Fliegen und Mücken darstellt , vor 250 Millionen Jahren (MYA) [51]. Darüber hinaus haben wir im Rahmen dieser Analyse zwei unterschiedliche Geneinträge für Ae identifiziert. aegypti CAT2 und zwei unterschiedliche Geneinträge für Ae. aegypti CAT3 in der Entrez Gene-Datenbank. Unser benachbarter Baum gruppierte einen Ae. aegypti CAT2 (GeneID: 5575859) zusammen mit unserer AaCAT1-Annotation [32], während die anderen Ae. aegypti CAT2 (GeneID: 5571884), geclustert mit unserer AaCAT2-Annotation (32) (Abb. 1a). Zusätzlich einer der beiden Ae. aegypti CAT3-Annotationen (GeneID: 5575863) geclustert mit unserer AaCAT3-Annotation [32], während die anderen Ae. aegypti CAT3-Annotation (GeneID: 5575110), geclustert mit unserem Ae. Anmerkung zum kationischen Aminosäuretransporter 5 (AaCAT5) von Aegypti [32] (Abb. 1a).

AaCAT1-Phylogenie- und Interaktionsscreening. a AaCAT1 und AaCAT3 stellen eine Erweiterung der Drosophila Slif CAT-Familie dar. Die CAT-Proteinsequenzen von Aedes aegypti wurden aus der NCBI-Proteindatenbank heruntergeladen, und auf die CAT-Proteinsequenzen von Drosophila melanogaster (Dmel) wurde über die FlyBase-Version FB2021_04 zugegriffen (37). Proteinsequenzen wurden mit MEGA11 ausgerichtet [38], und aus dem Mehrfachsequenz-Alignment wurde in MEGA11 ein nachbarschaftlich verbundener Baum generiert. Die Zahlen neben jedem Knoten stellen Bootstrap-Werte basierend auf 500 Replikationen dar. Sowohl AaCAT1 als auch AaCAT3 wurden zuvor in Ae als Slif annotiert. Ägypter. Unsere aktuelle Zusammenstellung zeigt, dass beide Transporter eine Homologie mit D. melanogaster Slif aufweisen und eine Erweiterung der Slif-Transporterfamilie während Ae darstellen. Aegypti-Evolution. Das rote Kästchen um AaCAT1 zeigt seine Verwendung in unserem Proteininteraktionstest an. Alle Gennamen ohne vorangestelltes Dmel sind Ae. Aegypti CAT-Anmerkungen. Klammern um Gencluster stellen unsere vorgeschlagenen Neuannotationen von Ae dar. aegypti CATs basierend auf diesem Baum. b Vorhergesagte Transmembranstruktur von AaCAT1. Zur Veranschaulichung der 14 Transmembranhelices wurde die webbasierte Anwendung Protter [40] verwendet. Die Substratspezifitätsstelle wurde markiert [34], und das C-terminale 28-Aminosäurefragment, das im Y2H-Assay als Köder verwendet wurde, ist durch Kreise gekennzeichnet, die den aus einem Buchstaben bestehenden Aminosäurecode enthalten. c Tabelle mit den fünf am stärksten interagierenden Proteinen mit mindestens zwei eindeutigen Treffern, bestimmt durch Y2H-Assay. d AaCAT1-Köderfragment für Pulldowns und GCN1-interagierende Fragmente. e Pulldown-Analyse der AaCAT1-GCN1-Interaktion. Die C-terminale Domäne von AaCAT1 wurde mit Fettkörperproteinen inkubiert und die resultierenden Komplexe auf Kobaltharz eingefangen. Die Coomassie-Blau-Färbung von vernetzten (x-vernetzten) und nicht vernetzten (nicht) Pulldown-Reaktionen unter Verwendung eines 6-His-markierten AaCAT1-Köderfragments (wie in d) und Fettkörperprotein zeigt eine eluierte Bande in der erwarteten Größe für die GCN1-Interaktion (durch Pfeil markiert). f GCN1 bindet an den C-Terminus von AaCAT1. Western-Blot der Pull-Down-Assay-Fraktionen bestätigt das Vorhandensein von GCN1 in der Pull-Down-Elutionsfraktion (durch Pfeil markiert). Köder, Nur-Köder-Kontrolle; FT, Durchflussfraktion; Elution, eluierte Fraktion; PD, Pulldown; Harz, Harzkontrolle; Wäsche, Harzwaschfraktion; Y2H, Hefe-Zwei-Hybrid; Weitere Begriffe finden Sie unter Abkürzungen

Die In-silico-Analyse der AaCAT1-Aminosäuresequenz mit dem PyMOL-Molecular-Viewer-Tool (https://pymol.org/2/) und dem Transmembran-Vorhersagetool TMHMM v2.0 [39] ermöglichte es uns, die Tertiärstruktur des Proteins vorherzusagen ( Zusätzliche Datei 1: Abbildung S1a) sowie die Identifizierung der transmembranen, intrazellulären und extrazellulären Regionen des Proteins (zusätzliche Datei 1: Abbildung S1b). Wir verwendeten diese vorhergesagten Domänen in Verbindung mit der von Verrey und Kollegen definierten CAT-Struktur (34), um das C-terminale Ende von AaCAT1 für das Hefe-Zwei-Hybrid-Screening auszuwählen. Mithilfe des Proteinlokalisierungsvorhersagetools DeepLoc-1.0 [52] haben wir außerdem festgestellt, dass sich AaCAT1 wahrscheinlich in der Plasmamembran und in den Lysosomen lokalisiert (Zusatzdatei 1: Abbildung S1c).

Unser Hefe-Zwei-Hybrid-Screening unter Verwendung des C-terminalen Schwanzes von AaCAT1 als Köder (Abb. 1b) ergab 207 Kolonien mit der vollständigen Reportergenaktivierung auf QDO-selektiven Medien mit hoher Stringenz (zusätzliche Datei 2: Datensatz). Aus diesen Kolonien wurden Beuteplasmide isoliert und sequenziert. Nach der Entfernung sowohl offensichtlicher als auch wahrscheinlich falsch positiver Ergebnisse basierend auf der Analyse der Beuteplasmidsequenz und bekannten Gewebe- und subzellulären Lokalisierungen von Beuteproteinen blieben 13 wahrscheinliche Proteininteraktoren übrig (Zusatzdatei 1: Tabelle S2). Davon wurden fünf Interaktoren in mindestens zwei verschiedenen Kolonien nachgewiesen (Abb. 1c). Der eIF2-alpha-Kinaseaktivator GCN1 war der interessanteste davon, da wir drei verschiedene Kolonien identifizierten, die von zwei separaten Klonen abgeleitet waren, die Plasmide enthielten, die interagierende Peptide vom C-terminalen Ende von GCN1 codieren (Abb. 1c, d), und weil GCN1 Es wurde bereits gezeigt, dass es an der GAAC-Regulierung der Translation in anderen Eukaryoten beteiligt ist [7, 9, 10, 14, 53].

Wir haben die Wechselwirkung zwischen AaCAT1 und GCN1 bestätigt, indem wir ein 6-His-markiertes Peptid entworfen haben, das derselben 28 Aminosäuren langen Sequenz des AaCAT1-C-Terminus entspricht, die für unseren Hefe-Zwei-Hybrid-Köder verwendet wird. Die Coomassie-Blau-Färbung zeigte die Retention einer Bande > 260 kDa in der Elutionsfraktion sowohl bei vernetzten als auch bei nicht vernetzten Pulldown-Assays (Abb. 1e). Western Blot von nicht vernetzten Pull-Down-Assay-Proben mit einem Anti-GCN1-Antikörper bestätigte das Vorhandensein von GCN1 in der Pull-Down-Elutionsfraktion (Abb. 1f).

Die durch qRT-PCR nachgewiesenen GCN1-Transkripte in erwachsenen weiblichen Organen waren in Organen am höchsten, die mit der Verdauung von Blutmehl und der Vitellogenese in Zusammenhang stehen. Die relativen GCN1-mRNA-Spiegel waren in den Eierstöcken signifikant höher als in den Köpfen, Thoraxen und Malpighian-Tubuli (Eierstöcke/Köpfe: ANOVA, F(5,12) = 6,391, P = 0,0033; Eierstöcke/Thoraxe: ANOVA, F(5,12) = 6,391, P = 0,0094; Eierstöcke/Malpighische Tubuli: ANOVA, F(5,12) = 6,391, P = 0,0212) (Abb. 2a). Fettkörper und Mitteldarm, die weitere für die Vitellogenese notwendige Organe sind, exprimierten GCN1-mRNA in Mengen, die sich nicht signifikant von denen in den Eierstöcken unterschieden (Eierstöcke/Fettkörper: ANOVA, F(5,12) = 6,391, P = 0,2028; Eierstöcke/Mitteldarm : ANOVA, F(5,12) = 6,391, P = 0,1877). Die Western-Blot-Analyse erwachsener weiblicher Organe ergab, dass die GCN1-Proteinspiegel in den Eierstöcken am höchsten waren. Wir haben auch GCN1-Protein im Fettkörper und in den Malpighian-Tubuli nachgewiesen, aber interessanterweise nicht im Mitteldarm. Schließlich stellten wir sowohl im Kopf als auch im Thorax geringe Mengen an GCN1-Protein fest. Dieses Expressionsmuster stimmt mit dem vieler Organe überein, in denen AaCAT1 zuvor nachgewiesen wurde [36], wobei die für die Vitellogenese verantwortlichen Hauptgewebe nachweisbare Mengen sowohl von AaCAT1 als auch von GCN1 enthalten. In-silico-Analyse der subzellulären GCN1-Lokalisierung mit DeepLoc-1.0 [52] zeigt, dass GCN1 höchstwahrscheinlich im Zytosol lokalisiert ist, sich aber auch im Zellkern lokalisieren kann (Zusatzdatei 1: Abbildung S2a) und mehrere mutmaßliche Kernlokalisierungssequenzen enthält, wie mit dem cNLS vorhergesagt Mapper-Tool [54] (Zusatzdatei 1: Abbildung S2b, c).

GCN1 wird in reproduktionsassoziierten Geweben exprimiert und seine Signalaktivität ist nach dem RNAi-vermittelten Knockdown reduziert. Eine qRT-PCR-Profilierung der GCN1-Expression in adulten Geweben (oben) und ein Western-Blot der GCN1-Proteinexpression (unten) zeigten die Expression von GCN1 in Eierstöcken, Fettkörper und Malpighian-Tubuli. Eine einseitige Varianzanalyse (ANOVA) gefolgt von Tukeys HSD-Post-hoc-Test wurde verwendet, um signifikante Unterschiede (P < 0,05) in der gcn1-Transkriptexpression zu bestimmen. Für den Western-Blot-Nachweis wurde ein 15-µg-Proteinaliquot jeder Probe geladen. b Western Blot der GCN1-Expression nach dsRNA-Injektion. c Die prozentuale GCN1-Expression im Vergleich zur GFP-dsRNA-Behandlung zeigt eine ähnliche Abnahme der GCN1-Expression 3 und 5 Tage nach der Injektion (PI), wobei ein Anstieg der relativen GCN1-Expression 7 Tage PI beginnt. Die Pixelintensität der GCN1-Banden in 2b (293 kDa, Pfeil) wurde unter Verwendung der Pixelintensität der hellen etwa 50-kDa-Bande (Pfeilspitze) standardisiert, die in allen Proben ähnliche Intensitäten aufwies. Für jede Probe (n = 1) wurde das Gesamtprotein aus Pools von 10 ganzen Mücken extrahiert und 15 µg Protein aus jeder Probe analysiert. d Repräsentative Western Blots von Phospho-eIF2α (p-eIF2α), eIF2α und Aktin aus drei Pools von fünf weiblichen Abdomen (n = 3), wobei die Mitteldärme entfernt wurden, nach Injektion von entweder GCN1-dsRNA oder grün fluoreszierendem Protein (GFP) dsRNA. Injizierte Mücken wurden zu verschiedenen Zeitpunkten nach der Blutmahlzeit (PBM) beprobt: 0 (nicht gefüttert), 6, 12 oder 24 Stunden PBM. Von jeder Probe wurde ein 10-µg-Aliquot des Gesamtproteins geladen. e Die Pixelintensitäten der p-eIF2α-Banden von mit GCN1 injizierten und GFP-injizierten Mücken im Blot von 2d wurden auf die Pixelintensität der eIF2α-Banden von 2d normalisiert, um die Änderung der p-eIF2α-Bandenintensität zu verschiedenen Zeitpunkten (PBM) darzustellen. Buchstaben stellen statistische Signifikanzgruppen (P < 0,05) dar, die durch Analyse mit einer einfaktoriellen ANOVA und anschließendem Tukey-HSD-Post-hoc-Test für signifikante Unterschiede zwischen Behandlungsgruppen und Zeitpunkten ermittelt wurden. FB, fetter Körper; ER, Kopf; OV, Eierstock; MG, Mitteldarm; TH, Thorax; MT, Malpighischer Tubulus; WM, ganze Mücke; Weitere Begriffe finden Sie unter Abkürzungen

Um einen optimalen Zeitrahmen für RNAi-Manipulationen zu bestimmen, injizierten wir einer kleinen Anzahl weiblicher Mücken 1 µg entweder GCN1-dsRNA oder GFP-dsRNA und isolierten Gesamtprotein aus Pools von 10 Mücken (n = 1) bei 3-, 5- und 7- Tage PI. Wir führten Western Blots mit einem Antikörper gegen Säugetier-GCN1 durch, um die GCN1-Proteinexpression in allen Proben zu untersuchen (Abb. 2b). Western Blots mit diesem primären Antikörper zeigten eine GCN1-Bande bei etwa 290 kDa und eine zusätzliche Bande bei etwa 50 kDa mit konsistenter Intensität in allen Proben (siehe Zusatzdatei 1: Abbildung S4d). Wir verwendeten Bandendichtemetrie zur Halbquantifizierung der Pixelintensitäten der GCN1-Banden (293 kDa) und normalisierten sie auf die 50 kDa-Bande, die wir als quasi-interne Ladungskontrolle verwendeten. Die prozentuale Verringerung der GCN1-Bandenintensität von GCN1-RNAi-Proben im Vergleich zu GFP-RNAi-Proben zu jedem Zeitpunkt wurde grafisch dargestellt, und wir beobachteten eine etwa 60-prozentige Verringerung der GCN1-Proteinspiegel sowohl in 3- als auch in 5-Tage-PI-Proben (Abb. 2c).

Um die Rolle von GCN1 in Ae aufzuklären. Aegypti Vitellogenesis haben wir Anti-GCN1-dsRNA entworfen und synthetisiert, um die GCN1-Genexpression zu unterdrücken. Da gezeigt wurde, dass GCN1 an der Nährstoffsignalisierung und Hungerreaktion in anderen Organismen beteiligt ist [9, 10, 11, 12, 14, 15, 53], wollten wir verstehen, ob der Abbau von GCN1 eine schnelle Letalität verursachen und sich nachteilig auf den künftigen Abbau auswirken würde Experimente in Ae. Aegypti-Mücken. Um die Letalität des GCN1-Knockdowns zu beurteilen, injizierten wir etwa 200 weiblichen Mücken entweder 1 µg GCN1-dsRNA (n = 199) oder 1 µg GFP-dsRNA (n = 205) als Injektionskontrolle und maßen die prozentuale Mortalität über 5 Tage PI. Beide Gruppen, dh die Knockdown- und die GFP-Kontrollgruppe, hatten eine Überlebensrate von > 80 % nach 5 Tagen PI (Zusatzdatei 1: Abbildung S3a). Die Überlebensraten von mit GCN1-dsRNA injizierten Mücken unterschieden sich zu keinem gemessenen Zeitpunkt signifikant von denen von mit GFP-dsRNA injizierten Kontrollen (Log-Rank-Mantel-Cox-Test, χ2 = 0,02547, df = 1, P = 0,8732) (Zusatzdatei 1). : Abbildung S3a).

Es ist bekannt, dass GCN1 GCN2 reguliert, das wiederum eIF2α phosphoryliert und die Proteintranslation in Hefe reguliert [12, 14]. Um zu testen, ob GCN1-dsRNA-Injektionen zu einem Abbau der funktionellen GCN1-Aktivität führten, führten wir Western Blots an drei Pools von Gesamtprotein durch, das aus dem Bauch von fünf Mücken zu verschiedenen PBM-Zeitpunkten (n = 3 zu allen Zeitpunkten) isoliert wurde, wobei die Mitteldärme entfernt wurden, um Blut zu vermeiden Kontamination (Abb. 2d; Zusatzdatei 1: Abb. S4e – g). Wir beobachteten eine signifikante Abnahme der eIF2α-Phosphorylierung in beiden Behandlungsgruppen bei 6-Stunden-PBM im Vergleich zu nicht gefütterten Mücken in jeder Gruppe (GCN1 nicht gefüttert-GCN1 6-Stunden-PBM: ANOVA, F(7,16) = 5,562, P = 0,0128; GFP nicht gefüttert- GFP 6 h PBM: ANOVA, F(7,16) = 5,562, P = 0,0183) (Abb. 2e). Dies weist darauf hin, dass der GAAC-Weg ein aktiver Nährstoffsensorschalter bei weiblichen Ae ist. aegypti, da sie während der Vitellogenese eine Blutmahlzeit verstoffwechseln.

Beim Vergleich der eIF2α-Phosphorylierung zwischen den Behandlungsgruppen beobachteten wir bei Mücken, denen GCN1-dsRNA injiziert wurde, im Vergleich zu Mücken, denen zu jedem Zeitpunkt GFP-dsRNA injiziert wurde, verringerte Mengen an phosphoryliertem eIF2α (Abb. 2d, oberes Feld) (Abb. 2e); Allerdings war dieser Rückgang zu keinem Zeitpunkt der Messung signifikant (ohne Nahrung: ANOVA, F(7,16) = 5,562, P = 0,9732; 6 h PBM: ANOVA, F(7,16) = 5,562, P = 0,9340; 12 h PBM: ANOVA, F(7,16) = 5,562, P = 0,9890; 24 h PBM ANOVA, F(7,16) = 5,562, P = 0,9506). Die als Ladungskontrollen verwendeten Gesamt-eIF2α- und Aktinspiegel waren in beiden Behandlungen ähnlich (Abb. 2d, mittlere und untere Tafel), was uns die Gewissheit gab, dass die verringerte eIF2α-Phosphorylierung, die wir bei den mit GCN1-dsRNA injizierten Mücken beobachteten, auf unseren Knockdown zurückzuführen war Behandlung.

Wir ernährten uns blutgefütterte Mücken, denen sowohl GCN1-dsRNA als auch GFP-dsRNA 5 Tage PI injiziert wurden, und beprobten dann Gruppen von Mücken zu unterschiedlichen Zeitpunkten (PBM) für die qRT-PCR-Analyse der vg-Expression. Wir beobachteten einen 2000-fachen Anstieg des vg-mRNA-24-Stunden-PBM im Vergleich zum nicht gefütterten Zustand bei mit GFP injizierten Mücken (Zusatzdatei 1: Abbildung S3b). Interessanterweise beobachteten wir keine Verringerung der vg-Expression bei Mücken, denen GCN1 injiziert worden war, im Vergleich zu Mücken, denen GFP injiziert worden war, da vg-mRNA bei Mücken, denen GCN1-dsRNA injiziert worden war, fast um das 3800-fache anstieg (Zusatzdatei 1: Abbildung S3b). Die Expression von vg-mRNA unterschied sich zu keinem Zeitpunkt der Messung signifikant (ungefüttert: ungepaarter t-Test, t(4) = 1,299, P = 0,2637; 6-Stunden-PBM: ungepaarter t-Test, t(4) = 0,2851, P). = 0,7897; 12 h PBM: ungepaarter t-Test, t(4) = 1,275, P = 0,2713; 24 h PBM: ungepaarter t-Test, t(4) = 0,1612, P = 0,8797).

Um die Auswirkungen des GCN1-Knockdowns auf die Fruchtbarkeit von Mücken zu bestimmen, injizierten wir weiblichen Mücken GCN1- oder GFP-dsRNA und sezierten dann Eierstöcke aus Gruppen von nicht gefütterten (0 h PBM) und bluternährten Weibchen nach 24, 48 und 72 h PBM (Abb. 3a). Die Eierstocklängen wuchsen bei Mücken, denen GCN1 injiziert worden war, während der ersten 48 Stunden PBM schneller, wobei sich die Längen nach 24 Stunden PBM deutlich unterschieden (24 Stunden PBM: ungepaarter t-Test, t(18) = 2,333, P = 0,0314). ; 48 h PBM: ungepaarter t-Test, t(18) = 0,8753, P = 0,3930). GCN1-injizierte Mücken-Eierstöcke hörten jedoch nach 48 bis 72 h PBM auf zu wachsen, als sie in der Länge von Eierstöcken von GFP-injizierten Weibchen überholt wurden, obwohl der Unterschied nicht signifikant war (ungepaarter t-Test, t(18) = 1,982, P = 0,0629) (Abb. 3b). Die Oozytenlängen unterschieden sich zu keinem Zeitpunkt der Messung (ungefüttert: ungepaarter t-Test, t(18) = 1,571, P = 0,1335; 24-Stunden-PBM: ungepaarter t-Test, t(18) = 1,339, P = 0,1972; 48). h PBM: ungepaarter t-Test, t(18) = 0,09389, P = 0,9262; 72 h PBM: ungepaarter t-Test, t(18) = 0,4433, P = 0,6628) (Abb. 3c).

Der Abbau von GCN1 beeinflusst die Fruchtbarkeit von Mücken. a Repräsentative Eierstöcke, aufgenommen von Mücken, denen entweder GCN1-dsRNA oder GFP-dsRNA zu angegebenen PBM-Zeiten injiziert wurde. Maßstabsbalken in jedem Bild: 500 µm. b, c Die Eierstocklängen (b) und die Längen von fünf repräsentativen Eizellen (c) wurden von 10 mit GCN1-dsRNA injizierten (n = 10) oder 10 mit GFP-dsRNA injizierten (n = 10) Mücken gemessen, die bei 0 h PBM (nicht gefüttert) entnommen wurden. , 24 h PBM, 48 h PBM oder 72 h PBM. Die Daten werden als durchschnittliche Länge der 10 Eierstockpaare (b) oder Eizellen (c) ± Standardfehler des Mittelwerts dargestellt. Gepaarte t-Tests wurden verwendet, um die statistische Signifikanz der Unterschiede zwischen den mit GCN1-dsRNA injizierten und den mit GFP-dsRNA injizierten Eierstock- und Eizellenlängen zu jedem Zeitpunkt zu bestimmen. d Eizahlen von Mücken, denen GFP-dsRNA injiziert wurde (n = 18) und GCN1-dsRNA-injizierten Mücken (n = 23). Einzelne mit dsRNA injizierte Weibchen wurden 5 Tage lang mit Blut gefüttert und in einzelne Eiablagekammern aufgeteilt. Eierpapier mit abgelegten Eiern wurde 96 Stunden lang im PBM gesammelt und vor der Zählung 48 Stunden lang getrocknet. Jeder Punkt stellt die Anzahl der von einer einzelnen Mücke gelegten Eier dar. Linien und Schnurrhaare stellen die mittlere Eizahl ± Interquartilbereich (IQR) dar. e Schlüpfraten von 12 (n = 12) zufällig ausgewählten Gelegen von Mücken, die in Teil c injiziert wurden. Linien und Schnurrhaare repräsentieren den mittleren Prozentsatz der pro Gelege geschlüpften Eier ± IQR. Die statistische Signifikanz (P < 0,05) der Eizahl- und Schlupfratendaten wurde mit Mann-Whitney-U-Tests unter Verwendung der GraphPad Prism 8-Software bestimmt

Wir haben die Kupplungsgrößen von Mücken gemessen, denen sowohl GCN1-dsRNA- (n = 23) als auch GFP-dsRNA-Mücken (n = 18) injiziert wurden. Der Abbau von GCN1 führte zu einer signifikanten (Mann-Whitney-U-Test, U(39) = 92,50, Z = − 3,01, P = 0,0021) Verringerung der Gelegegröße im Vergleich zu GFP-injizierten Kontrollen mit einem Median von 63 Eiern pro Gelege GCN1-Behandlungsgruppe im Vergleich zu einem Median von 88,5 Eiern pro Gelege in der GFP-Kontrollgruppe (Abb. 3d). Wir haben auch die Schlupfraten von 12 zufällig ausgewählten Gelegen der mit GCN1-Knockdown und GFP-dsRNA injizierten Kontrollmücken gemessen. Gelege, die von GCN1-Knockdown-Mücken gelegt wurden, hatten eine mittlere prozentuale Schlupfrate von 53 % und Kontrollgelege hatten eine mittlere prozentuale Schlupfrate von 75 %. Dieser Unterschied war statistisch nicht signifikant unterschiedlich (Mann-Whitney-U-Test, U(22) = 44, Z = − 1,62, P = 0,1135) (Abb. 3e).

In dieser Studie haben wir einen neuen Satz von Signalproteinen identifiziert, die wahrscheinlich Teil des Nährstoffsensors im Fettkörper, den Eierstöcken und anderen Geweben der Mücke sind [6, 30, 31, 35, 36, 45, 55, 56]. Wir entdeckten GCN1 als mutmaßlichen Interaktionspartner des C-Terminus eines CAT und zeigten, dass der Abbau von GCN1 die durch Aminosäuren induzierte Nährstoffsignalisierung und die Fruchtbarkeit von Mücken beeinflusst.

Wir begannen unsere Studie mit der Neuannotation der fünf Mücken-CAT-Proteine ​​der Aminosäuretransporter-Genfamilie vom SLC7-Typ [32, 34, 57]. Die NCBI-Gendatenbank enthält zwei unterschiedliche Einträge für Ae. aegypti CAT2 und CAT3 (AaCAT2, AaCAT3) und keine Einträge für Ae. aegypti CAT1 oder CAT5 (AaCAT1, AaCAT5). Unsere Analyse (Abb. 1a) unterstützt die erneute Annotation des CAT2-Geneintrags (GeneID: 5575859) als CAT1 und des CAT3-Geneintrags (GeneID: 5575110) als CAT5. Sowohl AaCAT1 als auch AaCAT3 gruppierten sich zusammen mit D. melanogaster Slif (Abb. 1a), was darauf hinweist, dass AaCAT1 und AaCAT3 eine Erweiterung der Slif-CAT-Familie während der Evolutionsgeschichte von Ae darstellen. Ägypter. In früheren Studien haben wir gezeigt, dass diese beiden eng verwandten Proteine ​​Aminosäuretransporter sind, jedoch völlig unterschiedliche Substratspezifitäten aufweisen. Während AaCAT3 eine breite Substratspezifität aufweist und nicht nur alle vier Arten kationischer Aminosäuren, sondern auch mehrere ungeladene Aminosäuren transportiert (35), ist AaCAT1 ein einzigartiger Histidin-spezifischer Transporter, der Teil des Fettkörper-Nährstoffsensors ist (36). Da gezeigt wurde, dass der Abbau von AaCAT1 die Nährstoffsignalisierung des Fettkörpers stört und diese weit stromaufwärts im Ziel des Rapamycin (TOR)-Signalwegs platziert [30], wählten wir den C-Terminus von AaCAT1 als Köder, um interagierende zytoplasmatische Proteine ​​zu identifizieren.

Unser Hefe-Zwei-Hybrid-Screening des AaCAT1-C-Terminus ergab 33 Proteintreffer, die wir als plausible Interaktoren von AaCAT1 erachteten. Viele davon könnten echte Interaktoren von AaCAT1 sein und wären Kandidaten für weitere Studien. Insgesamt deutet die Sammlung stark interagierender Proteine, die wir identifiziert haben (Abb. 1c), auf die Möglichkeit hin, dass AaCAT1 Teil eines Komplexes ist, der die Ladungsverteilung im Zusammenhang mit dem Transport geladener Aminosäuren steuern und verschiedene Stoffwechselreaktionen regulieren soll.

GCN1 war der interessanteste Kandidat, den wir identifiziert haben, da es an der Regulierung der Proteinsynthese während des Aminosäuremangels in Eukaryoten beteiligt ist [9,10,11,12, 14, 15, 53, 58]. Wir validierten diese Wechselwirkung zwischen AaCAT1 und GCN1 durch die Verwendung von In-vitro-Pulldowns mit His-markiertem AaCAT1-Köder und Proteinlysat-Beute. Dies schließt die Möglichkeit nicht aus, dass ein anderes Protein diese Wechselwirkung überbrücken könnte. Um vollständig zu bestätigen, dass es sich hierbei um eine direkte Interaktion handelt, müssen In-vitro-Pulldowns mit gereinigtem AaCAT1-Köder und GCN1-Beute durchgeführt werden. Unser Nachweis dieser Wechselwirkung durch mehrere Tests gibt uns jedoch die Gewissheit, dass sie wahrscheinlich in vivo auftritt, unabhängig davon, ob die Wechselwirkung direkt oder überbrückt ist. In Hefe bildet GCN1 einen Komplex mit mehreren Proteinen, einschließlich der Kinase GCN2, und dieser Komplex bindet an Ribosomen, wo GCN2 bei Aminosäuremangel ungeladene tRNAs erkennen und durch diese aktiviert werden kann [12,13,14,15]. Nach der Aktivierung phosphoryliert GCN2 die Alpha-Untereinheit des eukaryontischen Translationsinitiationsfaktor-2-Komplexes (eIF2α) [12,13,14,15,16], was zu einer Herunterregulierung der allgemeinen Translation und der Stimulierung der Translation einer kleinen Gruppe von Proteinen führt Gene, einschließlich des Transkriptionsfaktors ATF4 (general control nonderepressible 4 [GCN4] in Hefe), die den Aminosäurestoffwechsel regulieren [20, 21, 59]. Darüber hinaus ist dieser Signalweg an der Regulierung der mTOR-Aktivität in Eukaryoten beteiligt [23, 26]. Frühere Untersuchungen haben gezeigt, dass die mTOR-Signalübertragung während der Vitellogenese von Mücken von zentraler Bedeutung ist [6, 31, 45, 55] und dass die Verfügbarkeit von Aminosäuren nachweislich die mTOR- und S6K-Aktivität in Ae beeinflusst. aegypti [30,31,32, 45].

Da sich die AaCAT1-Interaktionsregion am C-terminalen Ende von GCN1 befindet und nicht mit ribosomalen oder GCN2-Interaktionsstellen in Hefe überlappt (14, 60), schlagen wir vor, dass GCN1, das mit AaCAT1 interagiert, als Andockstelle für Ribosomen dienen kann. Eine solche Interaktion würde es GCN1 ermöglichen, sowohl Veränderungen im Aminosäurezustand der Zelle schnell zu erkennen als auch die Effizienz der YPP-Translation zu erhöhen, indem Ribosomen in Bereiche mit hoher Aminosäurekonzentration rekrutiert werden. Es ist auch möglich, dass die Interaktion mit GCN1 für die AaCAT1-Aktivierung oder die Aufrechterhaltung der Transporterstabilität während der Vitellogenese notwendig ist, aber unsere GCN1-Knockdown-Daten unterstützen diese Annahme nicht. Diese Möglichkeit kann jedoch ohne weitere Tests der AaCAT-Aktivität nach GCN1-Knockdown nicht ausgeschlossen werden. Die von uns beobachtete Interaktion zwischen AaCAT1 und GCN1 kann an mehreren subzellulären Orten stattfinden. Erstens können GCN1 und AaCAT1 an der Plasmamembran der Zelle interagieren. Zweitens können GCN1 und AaCAT1 an sekretorischen Vesikeln interagieren, während AaCAT1 zur Zellmembran transportiert wird. Schließlich können GCN1 und AaCAT1 an Lysosomen interagieren. Dieser Ort der Interaktion ist möglich, da AaCAT1 voraussichtlich entweder auf der Zellmembran oder auf Lysosomen lokalisiert ist (Zusatzdatei 1: Abbildung S1) und Lysosomen bekanntermaßen als Aminosäurespeicherstelle (61) und als Drehscheibe für Amino dienen Säuresignalisierung über den TOR-Weg [62, 63]. Weitere Studien sind erforderlich, um zu klären, welche Beziehungen zwischen GCN1, mTOR und Lysosomen während der Vitellogenese bestehen können und wo diese Wechselwirkungen innerhalb der Zelle stattfinden. Um zu verstehen, wie sich GCN1 mit der mTOR-Signalübertragung überschneiden kann, könnte eine Hefe-Zwei-Hybrid-Studie mit GCN1-Proteinfragmenten als Köder Wechselwirkungen zwischen GCN1 und Proteinen im mTOR-Signalweg identifizieren. Darüber hinaus ist das Aufkommen von Clustered Regular Interspaced Short Palindromic Repeat/CRISPR-assoziiertem Protein 9 (CRISPR/Cas9) Gen-Editing und Techniken wie der rezeptorvermittelten Eierstock-Transduktion von Fracht (REMOT Control) möglich, die den Einsatz von CRISPR/Cas9 zur genetischen Entwicklung ermöglichen Linien durch Injektion erwachsener weiblicher Mücken [64] ermöglichen die Erzeugung von Knockout-Linien für GCN1- oder mTOR-Signalwegproteine. Dies kann die Gestaltung von Experimenten in einem GCN1- oder mTOR-Signalisierungs-Null-Genhintergrund ermöglichen, der weiter aufklären kann, wie GCN1 und der GAAC-Signalweg mit der mTOR-Signalisierung interagieren können, um die Vitellogenese zu regulieren. Die auf CRISPR/Cas9 basierende Bearbeitung kann auch die homologiegesteuerte Reparatur nutzen, um fluoreszierende Markierungen präzise in GCN1- oder mTOR-Signalgene einzuschleusen, was den Einsatz von Fluoreszenztechniken wie dem Fluoreszenzresonanzenergietransfer (FRET) zur Identifizierung von GCN1 ermöglicht interagiert direkt mit mTOR oder anderen mTOR-Signalproteinen im Ae. Aegypti-Fettkörper oder andere Gewebe zu unterschiedlichen Zeiten vor und während der Vitellogenese.

Die Western-Blot-Banden-Densitometrie von phosphoryliertem eIF2α, normalisiert auf eIF2α als Ladungskontrolle, zeigte eine signifikante Abnahme der eIF2α-Phosphorylierung 6 h PBM bei Mücken, denen entweder GCN1-dsRNA oder GFP-dsRNA injiziert wurde (Abb. 2d, e). Diese Veränderung ist zu erwarten, wenn der GAAC-Signalweg an der Nährstoffwahrnehmung beteiligt ist, wenn weibliche Mücken von einer Aminosäuren-armen Ernährung aus Saccharose (im Labor) oder Nektar (in der Wildnis) zu einer Blutmahlzeit mit einem hohen Aminosäurengehalt übergehen. Wir interpretieren dieses Ergebnis als Hinweis darauf, dass der GAAC-Weg eine aktive Rolle bei der Vermittlung des Stoffwechselwechsels zur Produktion von YPPs zu Beginn der Vitellogenese spielt. Bei der Untersuchung der Auswirkung des GCN1-Knockdowns auf die Aktivität des GAAC-Signalwegs beobachteten wir eine verringerte eIF2α-Phosphorylierung bei mit GCN1-dsRNA injizierten Mücken im Vergleich zu mit GFP-dsRNA injizierten Mücken vor der Blutmahlzeit und in den ersten 24 Stunden des PBM (Abb. 2d, e). . Die statistische Analyse dieser Abnahme ergab keinen signifikanten Knockdown-Effekt auf die eIF2α-Phosphorylierung. Es wurde gezeigt, dass die GCN2-Kinaseaktivität durch den ribosomalen P-Stiel in anderen Eukaryoten reguliert wird (65, 66). Daher ist es möglich, dass eine funktionelle Redundanz bei der GCN2-Aktivierung durch Mücken-Ribosom-P-Stiele erklärt, warum wir eine nicht signifikante Verringerung von beobachteten eIF2α-Phosphorylierung nach Unterdrückung der GCN1-Expression.

Interessanterweise hatte der GCN1-Knockdown keinen Einfluss auf die durch qRT-PCR nachgewiesene Expression von vg-mRNA (zusätzliche Datei 1: Abb. S3b), wir beobachteten jedoch Unterschiede in der Fruchtbarkeit weiblicher Mücken, denen GCN1-dsRNA injiziert wurde, im Vergleich zu GFP-dsRNA-Kontrollen (Abb . 3). Wir haben zuvor Daten zur Fruchtbarkeit und Schlupfrate anhand von Stichprobengrößen veröffentlicht, die mit denen vergleichbar sind, die in der vorliegenden Studie verwendet wurden [67]. Obwohl wir zuversichtlich sind, dass unsere Daten die Auswirkung des GCN1-Knockdowns auf die Fruchtbarkeit genau wiedergeben, sind zukünftige Experimente darauf ausgelegt, die genaue Aussage zu verstehen Die Rolle von GCN1 bei der Fruchtbarkeit von Mücken wird größere Stichprobengrößen umfassen. Der Abbau von GCN1 sollte andere Faktoren, von denen bekannt ist, dass sie für die Transkription des YPP-Gens notwendig sind, nicht hemmen, einschließlich der 20-Hydroxyecdyson (20-E)-Signalübertragung, der Juvenilhormon-Signalisierung oder der Insulin-ähnlichen Peptid-Signalisierung [31]. Wir schlagen drei mögliche Erklärungen dafür vor, wie der Abbau von GCN1 die Gelegegröße beeinflussen kann, ohne die YPP-Gentranskription in den von uns durchgeführten Experimenten zu beeinträchtigen. Erstens könnten diese Ergebnisse auf eine funktionelle Redundanz bei der GCN2-Aktivierung durch ribosomale P-Stiel-Proteine ​​zurückzuführen sein. Zweitens können diese Ergebnisse durch eine erhöhte Proteintranslation in der mit GCN1-dsRNA behandelten Mückenmahlzeit vor der Blutmahlzeit verursacht werden, wodurch die Aminosäurespeicher vor der Blutmahlzeit erschöpft wurden, was zu einer verringerten Effizienz der YPP-Synthese führte. Drittens kann der Abbau von GCN1 zu einer gestörten Ribosomenrekrutierung während der Vitellogenese führen, was die Effizienz der YPP-Synthese verringert. Zukünftige metabolomische und proteomische Studien sowie Ribosomenreinigungsstudien an GCN1-Knockdown-Mücken werden Aufschluss darüber geben, welcher dieser Mechanismen möglicherweise eine Rolle bei der GCN1-vermittelten Veränderung der Fruchtbarkeit spielt.

Unsere Analyse der GCN1-Lokalisierung zeigte, dass GCN1 in höheren Konzentrationen in Geweben exprimiert wird, die an der Verarbeitung von Blutmehlnährstoffen und der Vitellogenese beteiligt sind, insbesondere in den Eierstöcken, im Fettkörper und im Mitteldarm. Interessanterweise konnten wir im Mitteldarm nicht gefütterter weiblicher Mücken mit qRT-PCR GCN1-mRNA nachweisen, im Western Blot jedoch kein GCN1-Protein. Wir gehen davon aus, dass Mitteldarmgewebe die GCN1-Proteinexpression auf andere Weise regulieren als andere metabolisch wichtige Organe, beispielsweise durch posttranskriptionelle Regulierung, da Mitteldarmzellen nicht so viele Nährstoffe speichern wie der Fettkörper und die Eierstöcke und möglicherweise nur GCN1-Aktivität benötigen Übergangspunkte rund um die Bluternährung. Zukünftige Studien sollten entwickelt werden, um festzustellen, ob GCN1-mRNA in diesem Gewebe sequestriert oder von microRNAs angegriffen wird. Unsere Beobachtung einer erhöhten GCN1-Expression, die durch qRT-PCR und Western Blot in Eierstöcken im Vergleich zu anderen erwachsenen weiblichen Geweben nachgewiesen wurde (Abb. 2a), zeigt, dass GCN1 eine wichtige Rolle im Eierstockstoffwechsel spielt, die untersucht werden sollte. Es ist wahrscheinlich, dass GCN1 sowohl in den Eierstöcken als auch im Fettkörper eine ähnliche Funktion ausübt, da beide Gewebe während der Vitellogenese erhebliche metabolische Veränderungen erfahren. Es kann auch sein, dass endogenes GCN1 in den Eizellen dazu dient, den Aminosäurestoffwechsel während der Embryogenese zu regulieren. Kürzlich wurde GCN1 mit der Regulierung der Zellproliferation auf GCN2-unabhängige Weise in embryonalen Mäusezellen in Verbindung gebracht, die aus GCN1-mutierten Embryonen entstanden sind [58]. Zukünftige Studien, einschließlich der direkten Bestimmung des GCN1-Knockdown-Effekts auf bestimmte Gewebe, müssen durchgeführt werden, um die genaue Rolle der AaCAT1-GCN1-Interaktion bei Ae zu bestimmen. Aegypti Vitellogenese.

Die Identifizierung von Interaktoren von AaCAT1 und ihre Beteiligung an Zellsignalwegen liefern wichtige Einblicke in Nährstoffsignalwege. Durch die Identifizierung der an diesen Signalwegen beteiligten Proteine ​​können chemische Ziele oder Inhibitoren entwickelt werden, die spezifisch für die identifizierten Proteine ​​sind. Unsere Analyse der Proteininteraktionen mit nur einem von fünf Ae. aegypti CATs hat einen Zusammenhang zwischen AaCAT1 und einem zweiten Nährstoffsensorweg aufgedeckt, der zuvor keine Rolle bei Ae spielte. Aegypti-Nährstoffsignalisierung. Da es immer mehr CAT-Wechselwirkungen zu untersuchen gilt, gepaart mit unserem wachsenden Verständnis der GCN1-Aktivität, wird unser Bild des Nährstoffsensorsystems in Mücken immer komplexer.

Die Datensätze, die die Schlussfolgerungen dieses Artikels stützen, sind im Artikel (und seinen zusätzlichen Dateien) und auf begründete Anfrage beim entsprechenden Autor erhältlich.

Aedes aegypti kationischer Aminosäuretransporter 1, 2, 3, 5

Aminosäurereaktion

Aktivierung des Transkriptionsfaktors 4

CRISPR-assoziiertes Protein 9

Kationischer Aminosäuretransporter

Kationischer Aminosäuretransporter 1, 2, 4 bzw. 5

Kostenlose DNA

In regelmäßigen Abständen angeordnete kurze palindromische Wiederholungen

Doppelter Ausfall (Medien)

Dimethylsulfoxid

Desoxyribonukleosidtriphosphat

Doppelsträngige RNA

Disuccinimidylsulfoxid

Dithiothreitol

Ethylendiamintetraessigsäure

Eukaryontischer Translationsinitiationsfaktor 2-Untereinheit Alpha

Fluoreszenzresonanz-Energieübertragung

Allgemeine Aminosäurekontrolle

Allgemeine Kontrolle nicht unterdrückbar 1, 2, 4 bzw. 20

Grün fluoreszierendes Protein

Heterodimerer Aminosäuretransporter

Octylphenoxypoly(ethylenoxy)ethanol, verzweigt

Molekulare evolutionäre Genetikanalyse

Messenger-RNA

Mechanistisches Ziel von Rapamycin

Mechanistisches Ziel des Rapamycin-Komplexes 1

Vor Millionen Jahren

Nationales Zentrum für biotechnologische Informationen

Nicht rückwärts transkribiert

Oligomerisiertes Desoxythymidin

Ribosomale Protein-S6-Kinase Beta-1

Mahlzeit nach dem Blut

Nacheinspritzung

Polyvinylidendifluorid

Vierfacher Ausfall (Medien)

Quantitative Reverse-Transkriptions-PCR

Rezeptorvermittelte Eierstocktransduktion von Fracht

RNA-Interferenz

Ribosomales Protein S7

Synthetische definierte Medien

Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese

Familie gelöster Träger 7

Slimfast

Tris-Acetat-EDTA-Puffer

Tris-gepufferte Kochsalzlösung

Tris-gepufferte Kochsalzlösung + 0,05 % Tween-20

Ziel von Rapamycin

RNA übertragen

Vitellogenin

Eigelb-Vorläuferprotein

20-Hydroxyecdyson

6-Histidin

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Referenzen herunterladen

Das folgende Reagenz wurde vom NIH/NIAID Filariasis Research Reagent Resource Centre zur Verteilung über BEI Resources, NIAID, NIH bereitgestellt: Aedes aegypti, Strain Black Eye Liverpool, Eggs, NR-48921. Plasmid 3' EGFP pXOON wurde von Dr. Dmitri Boudko bereitgestellt. Die Autoren danken Carolyn Armendariz und Hailey Luker für ihre Unterstützung bei der Mückenaufzucht und Harley Bendzus-Mendoza für ihre Unterstützung bei der statistischen Analyse.

Diese Arbeit wurde durch die Zuschüsse #5SC1GM125584 und #1R35GM144049 des National Institute of Health, des NMSU Post-Doctoral Fellows Program, des NMSU Howard Hughes Medical Institute und des New Mexico Alliance for Minority Participants Undergraduate Research Scholars Program unterstützt.

Abteilung für Biologie, New Mexico State University, Las Cruces, NM, USA

Matthew Pinch, Theodore Muka, Yashoda Kandel, Mahesh Lamsal, Nathan Martinez, Marialuisa Teixeira und Immo A. Hansen

ReCode Therapeutics, Dallas, TX, USA

Dmitri Y. Boudko

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MP führte Hefe-Zwei-Hybrid-Assays, Pull-Down-Assays, qRT-PCR, dsRNA-Synthese, RNAi-Knockdowns, Western Blots durch, analysierte Daten und bereitete Abbildungen vor. 1, 2, 3 und Tabellen 1, 2, 3, bereitete zusätzliche Daten vor und verfasste das Manuskript. TM führte Hefe-Zwei-Hybrid-Assays, Pull-Down-Assays, dsRNA-Synthese und RNAi-Knockdowns durch, analysierte Daten und erstellte Abbildungen. 1 und 3, bereitete zusätzliche Daten vor und verfasste das Manuskript. YK führte RNAi-Knockdowns und Eierstockbildgebung durch, analysierte Daten und bereitete Abb. 3 vor. ML führte Western Blots und qRT-PCR durch. NM führte Western Blots durch. MT führte eine qRT-PCR durch. DYB steuerte Reagenzien bei und generierte zusätzliche Zahlen. IAH war an der Konzeption der Experimente beteiligt und verfasste das Manuskript. Alle Autoren lesen und genehmigen das endgültige Manuskript.

Korrespondenz mit Immo A. Hansen.

Unzutreffend.

Unzutreffend.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

Springer Nature bleibt neutral hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten.

Anmerkungen aller CAT-Einträge, die für den CAT-Annotationsbaum verwendet werden. Tabelle S2. Potenzielle Proteininteraktoren, identifiziert durch AaCAT1-Hefe-Zwei-Hybrid-Screening. Abbildung S1. Ae. aegypti AaCAT1 ist ein Transmembranprotein, das sich auf der Plasmamembran befindet. A. Die Tertiärstruktur des AaCAT1-Proteins wurde mit PyMOL (https://pymol.org/2/) visualisiert. B. Das TMHMM-Transmembran-Vorhersagetool, Krogh et al. [39] wurde verwendet, um die Transmembrandomänen sowie intrazelluläre und extrazelluläre Regionen von AaCAT1 vorherzusagen, um das Köderfragment für die Hefe-Zwei-Hybrid-Analyse zu entwerfen. C. Es wird vorhergesagt, dass sich AaCAT1 in der Plasmamembran lokalisiert, wie mit dem subzellulären Lokalisierungstool DeepLoc-1.0 von Almagro Armenteros et al. bestimmt wurde. [52]. Abbildung S2. In-silico-Vorhersagen der subzellulären Lokalisierung von GCN1. A. Man geht davon aus, dass sich GCN1 im Zytoplasma ansiedelt, aber möglicherweise auch im Zellkern. B. Die vorhergesagten Kernlokalisierungssequenzen (NLS), die in GCN1 gefunden wurden, zeigen mehrere NLS mit Werten, die auf ein gemischtes Kern-Zytoplasma-Lokalisierungsmuster hinweisen. C. Ergebnis aus Teil b, das die Position des vorhergesagten NLS im Kontext der GCN1-Aminosäuresequenz zeigt. Die Vorhersage der subzellulären Lokalisierung wurde mit dem subzellulären Lokalisierungstool DeepLoc-1.0 von Almagro Armenteros et al. durchgeführt. [52]. Die NLS-Vorhersage wurde mit dem cNLS Mapper-Vorhersagetool von Kosugi et al. durchgeführt. [54]. Abbildung S3. Der Abbau von GCN1 ist nicht tödlich und hat keinen Einfluss auf die YPP-Transkription. A. Das Überleben von mit GCN1-dsRNA injizierten und GFP-dsRNA-injizierten Kontrollmücken unterschied sich bis zu fünf Tage nach der Injektion nicht signifikant. Ein Log-Rank-Mantel-Cox-Test wurde verwendet, um signifikante Unterschiede zwischen den beiden Behandlungen zu testen. B. qRT-PCR-Analyse der vg-Transkription in GCN1-dsRNA-injizierten und GFP-dsRNA-injizierten Kontrollmücken. Pro Behandlung wurden zu jedem Zeitpunkt drei biologische Replikate analysiert und die vg-mRNA-Spiegel wurden auf β-Actin-mRNA normalisiert, bevor die fache Änderung der vg-Expression während der ersten 24-Stunden-PBM berechnet wurde. Gepaarte t-Tests wurden verwendet, um zu jedem Zeitpunkt signifikante Unterschiede zwischen den beiden Behandlungen zu testen. Abbildung S4. Western-Blot- und Coomassie-Blau-Bilder, die in den Hauptfiguren verwendet werden, ohne Zuschneiden, Farbentfernung und Helligkeits-/Kontrastkorrektur. Die Beschriftung über jedem Bild enthält einen Verweis auf die Haupttextfigur, in der das Bild enthalten ist.

: Datensatz S1. Excel-Arbeitsmappe mit allen Hefe-Two-Hybrid-Prey-Sequenzen aus Kolonien mit Single-Prey-Plasmidkopien. Jede Zeile stellt das Ergebnis einer einzelnen Kolonie dar und enthält die Sequenz von Beuteinserts, die vom T7-Promotor im pGAD-T7-Beuteplasmid generiert wurden.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Pinch, M., Muka, T., Kandel, Y. et al. Allgemeine Kontrolle Nonderepressible 1 interagiert mit dem kationischen Aminosäuretransporter 1 und beeinflusst die Fruchtbarkeit von Aedes aegypti. Parasiten Vektoren 15, 383 (2022). https://doi.org/10.1186/s13071-022-05461-x

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Eingegangen: 23. März 2022

Angenommen: 27. August 2022

Veröffentlicht: 21. Oktober 2022

DOI: https://doi.org/10.1186/s13071-022-05461-x

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